[发明专利]烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒

说明书

本申请公开了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT‑LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒，RT‑LAMP检测引物为CH‑CP‑3或CH‑CP‑4。本申请提供了针对南美红辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）的RT‑LAMP检测引物对，采用该引物对能有效避免产生假阳性结果，提高检测准确性，同时还能有效缩短检测所需时间至50min。且RT‑LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果）且灵敏度是RT‑PCR的100倍，较RT‑PCR简单容易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要。

技术领域

本申请涉及烟草检测技术领域，特别是一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒。

背景技术

南美红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其基因组由一条正单链RNA组成，全长约9700bp，主要依靠各种蚜虫以非持久性传播。

1979年在马来半岛的辣椒上首次发现了ChiVMV，我国于2003年首次在陕西省的辣椒上发现ChiVMV，随后2010年在云南省大理市巍山县的烟田里发现烟草受ChiVMV侵害，其侵染烟草后主要症状为褪绿黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷，并造成严重经济损失。病毒检测是监测、预报、防控病毒病的重要环节。目前检测ChiVMV的方法主要有电子显微镜技术、免疫血清学技术（ELISA）、指示植物检测技术以及分子生物学技术（RT-PCR）等。

指示植物方法首先需培养指示植物，并在指示植物上接种病毒；这导致该检测方法耗时较长可长达半个月以上，且其只能进行初步检测。

RT-PCR检测方法则需提取植物组织里的病毒RNA，以RNA为模板进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板借用PCR仪器进行扩增反应，再用扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；该检测方法所需步骤复杂，耗时较长约5~6h。

ELISA检测方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，包括一抗二抗的包被等操作；该方法需要获得与检测病毒特异性结合的单克隆抗体，所需时间长，且所得抗体也存在与其它病毒产生交叉反应导致假阳性检测结果出现的情况。

这些检测方法因技术复杂、费时费力、所需资金大等原因难以在基层田间推广。

2000年日本学者Notomi等人发明的环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）属于分子生物学研究领域中一种极为重要的手段，该检测技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，为加快实验进程再加设一对环引物，利用一种DNA链置换聚合酶（BstDNApolymerase）只需一个水浴锅在恒温条件（65℃左右）保温70~90分钟完成核酸扩增反应，通过荧光染色等方法在数分钟内即可观察结果。该方法相对上述现有方法检测效率大大提高。

但LAMP检测方法只针对DNA模板进行扩增，为实现用该方法以RNA模板进行扩增，需在LAMP反应体系中加入反转录酶，可以在某等温条件下一步进行RNA逆转录和核酸扩增，即为反转录-环介导等温扩增技术（ReverseTranscriptionLoop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP）。该技术成本低、灵敏度极高、操作简单，不需要昂贵的仪器和分析手段，适用于田间基层进行病毒检测。

CN201510527415.9中公开了一种检测辣椒脉斑驳病毒（PVMV）的RT-LAMP引物及试剂盒，其中公共了能用于检测PVMV的RT-LAMP引物，PVMV与本发明中涉及的ChiVMV虽中文名称相似，实际上是两种不同的病毒，其中公开的引物无法用于南美红辣椒脉斑驳病毒的检测，也无法解决RT-LAMP检测ChiVMV时，结果中阳性率偏高的问题。