[发明专利]一种耐酸差向异构酶突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的耐酸突变体I114R、该突变体酶的基因序列、包含该酶基因序列的重组表达载体以及含有载体的工程菌株。本发明还提供了重组表达载体和工程菌株构建方法，以及利用工程菌株制备该耐酸突变体的方法。本发明耐酸突变体I114R具有优异的活性和酸稳定性，其相对活性较之野生型提高30.7％。耐酸突变体I114R在pH4.5的环境中孵育2h后的相对活性是野生型的9.7倍，甚至在pH3.0的环境下孵育2h后仍能检测到活性。耐酸突变体酶I114R在酸性环境下体现出的优异耐受力和活性能够充分满足D‑阿洛酮糖的生产要求，可应用于D‑阿洛酮糖的工业制糖工艺。

技术领域：

本发明属于酶突变体构建及应用领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DAE)的耐酸突变体及其应用。

背景技术：

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种具有广泛生理功能的顺式己醛糖，是果糖C3位差向异构体。D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70％，但其热值仅为蔗糖的0.3％，是很理想的低热量蔗糖替代物。此外，D-阿洛酮糖能够抑制D-葡萄糖和D-果糖的吸收，提高胰岛素敏感性，进而减少体内脂肪的堆积。D-阿洛酮糖还可以通过增加脂肪的氧化，同时减少碳水化合物的氧化来减轻脂肪量，因此，D-阿洛酮糖可以有效地预防肥胖症和Ⅱ型糖尿病。与此同时，D-阿洛酮糖可以抑制前炎性细胞活性，因此具有抗炎的作用，还具有清除活性氧能力以及通过提高细胞内谷胱甘肽含量保护神经的作用。

目前D-阿洛酮糖的生物合成路径主要有三条，(1)经D-阿洛酮糖3差向异构酶酶催化D-果糖得到D-阿洛酮糖；(2)经葡萄糖异构酶(GI)催化D-葡萄糖为D-果糖，D-果糖再经路径；(3)经氧化还原酶催化阿洛醇得到D-阿洛酮糖。目前，生物合成D-阿洛酮糖主要是由D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化D-果糖得到。Kim等在根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens str.C58)中发现一种可特异性催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的酶，转化率达到32.9％。Zhu等利用异源表达具有组合突变体DAE酶的枯草芽孢杆菌工程菌株作为生物催化剂，以750g/L D-果糖为底物，60℃反应可得到262.5g/L D-阿洛酮糖，转化率达到35％。

然而大多数D-阿洛酮糖酮-3-差向异构酶的最适pH范围为7.0-9.0(偏碱性)，而制糖工业的生产是在偏酸性的条件下进行，因为在中性或弱碱性条件下，D-阿洛酮糖的羟基倾向于与氨基相互作用，导致非酶褐变反应加剧，糖液颜色加深，从而降低产品纯度，增加分离难度。然而，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在低pH值下会很快失活，无法在酸性条件下使用。因此，随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，提高D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酸稳定性对于解决工业D-阿洛酮糖制造问题至关重要。

发明内容：

本发明技术方案如下：

本发明提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的耐酸突变体I114R，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，以来源于纤维素梭菌H10的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列(GenBank Accession No.ACL75304)为亲本，通过定点突变技术将其活性催化中心的第114位的氨基酸残基由异亮酸突变成精氨酸所得。

进一步地，本发明提供编码上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶耐酸突变体I114R的基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ IDNO:1所示的基因序列。

优选地，所述重组表达载体为pPIC9k、pMA5或pET载体。

进一步地，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。