[发明专利]一种耐酸差向异构酶突变体及其应用

权利要求书

1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的耐酸突变体I114R，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的耐酸突变体I114R的基因，其基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:1所示的基因序列。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pPIC9k、pMA5或pET载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。

7.一种包含权利要求2所述的耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将来源于纤维素梭菌的野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因序列合成连接至表达载体上，得到含有野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因的重组表达载体；其中，用于连接野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因序列的表达载体为pET22b、pPIC9k或pMA5载体；

2)以步骤1)构建的重组表达载体为模板，设计定点突变引物I114R-F和I114R-R进行定点突变PCR扩增反应；反应后的PCR产物用DpnI酶消化1h后再进行环化；其中，所述定点突变引物I114R-F和I114R-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

3)取微量环化产物，采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞中，复苏培养后再涂平板过夜培养；待长出转化子后，挑取转化子置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD₆₀₀达到2.0～3.0后提质粒进行测序验证，测序验证正确的质粒即为包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体。

8.一种利用权利要求7所述的包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体构建工程菌株的方法，其特征在于：将所述包含耐酸突变体酶基因序列的重组表达载体通过热激转化法转入宿主菌感受态细胞中，复苏培养后再涂平板过夜培养；待长出转化子后，挑取转化子于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min培养6～8h后再转瓶扩大培养，获得工程菌株。

9.根据权利要求8所述的工程菌株构建方法，其特征在于：用于所述热激转化法的宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸菌。

10.一种利用权利要求8所述的工程菌株制备耐酸突变体酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将所述工程菌株在液体培养基中扩大培养至菌液浓度OD₆₀₀达到0.6～0.8，之后加入终浓度为0.5mM的IPTG，于16℃，120rpm/min诱导培养16h；

2)诱导培养后，将菌液离心收集菌体，菌体用Lysis Buffer重悬后加入终浓度为200μg/mL的溶菌酶和终浓度为120μg/mL的PMSF，搅拌重悬20min；

3)重悬菌体用超声破碎仪进行破碎，破碎后的菌体于4℃下12000rmp离心30min获取上清，将上清液与事先经Lysis Buffer平衡好的树脂搅拌结合1h；

4)待上清液与树脂充分结合后过Ni-NTA亲和层析柱，之后依次用Lysis Buffer和Elution Buffer两种缓冲液漂洗树脂；

5)将Elution Buffer漂洗树脂后得到的含有目标蛋白的洗脱液用pH 7.4的磷酸盐缓冲液置换，获得耐酸突变体酶I114R。