[发明专利]一种蝇类蛹期石蜡切片制作方法

说明书

本发明公开了一种蝇类蛹期石蜡切片制作方法，涉及组织切片研究技术领域，特别适应于昆虫蛹期的相关研究中。包括组织预处理与固定、组织脱水、组织透明、组织浸蜡、组织包埋、切片与展片、组织脱蜡、组织染色、组织脱水与透明、封片和观察，最终切片对组织区分度高，能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构。采用该方法处理大头金蝇蛹体，在显微镜下可以清晰观察到脑组织、复眼、体壁、肌肉、消化系统、排泄系统等的结构。本发明为昆虫学中蝇类蛹体组织切片提供了技术方法，可观察昆虫蛹体内部结构的改变，用以相关类群的系统发育研究及种属鉴定等问题，尤其在法以昆虫学中，可用于利用蛹体推断死亡时间等问题。

技术领域

本发明涉及组织切片研究技术领域，具体为一种蝇类蛹期石蜡切片制作方法。

背景技术

双翅目蝇类中，有些种类取食植物，是农林业重要害虫，有些种类携带病原菌，是重要的卫生害虫，有些种类作为捕食者或寄生者，在害虫控制中作用明显，有些种类具有食腐性和嗜尸性，在生态系统降解有机质中起着重要的作用。而作为一门新兴学科，法医昆虫学，也是利用蝇类的生长发育规律推断尸体最短死亡时间。

目前，现有的冷却机在长期的使用过程中会产生大量的热量，若是不对这些热量进行及时的疏导则会导致对包埋盒内部虫体冷却效果不好的问题出现，从而会导致研究结果不精准、出现偏差的问题出现，因此，需要进一步改进。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种蝇类蛹期石蜡切片制作方法，实现了解决上述问题的目的。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种蝇类蛹期石蜡切片制作方法，包括冷却机，方法包括以下过程：

S1，组织预处理与固定：

利用昆虫解剖针将蛹壳剥离，注意在解剖时不要用解剖针用力的拨动蛹体，蛹体比较脆弱，极易破坏内部组织，解剖完的虫体放入75％的酒精中清洗，然后将虫体浸于组织固定液中4℃过夜，固定时间不少于12h，本要求的组织固定液为：0.5％多聚甲醛混合固定液；

S2，组织脱水：

取组织固定后的虫体，室温下通过不同梯度的乙醇溶液进行脱水，浓度梯度依次为70％、80％、90％、95％、100％、100％、100％，每个梯度处理时间至少为1h；

S3，组织透明：

取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡；透明剂分别为二甲苯与乙醇体积比为1:2、1:1、2:1的混合液，室温下透明时间分别为30min，最后在100％的二甲苯溶液中透明1h；

S4，组织浸蜡：

65℃下提前将石蜡融化，组织透明后的虫体在石蜡一液体中浸泡4h，然后将虫体放在石蜡二液体中浸泡4h；

S5，组织包埋：

将包埋盒底部浸入一层底蜡，将浸蜡后的虫体置于底蜡中，根据研究内容确定虫体摆放方向，然后浸满石蜡，将包含虫体的整个包埋盒置于冷却机上加速冷却，待完全冷却后，准备用于切片；

S6，切片与展片：

将干净的载玻片提前放在包埋机上预热，包埋机温度设定为40℃，毛笔蘸取切下的薄片置于蒸馏水中，然后拿载玻片吸附水上的切片，切片会自然完全粘附在载玻片上，置于37℃条件下烘片12h以上进行粘片；

S7，组织脱蜡：

将干燥好的载玻片浸泡在100％二甲苯溶液一、100％二甲苯溶液二中，时间分别为5min，然后依次转移到100％、100％、90％、80％、70％乙醇溶液中浸泡6-8min，最后在蒸馏水中处理5min；

S8，组织染色：