[发明专利]用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了基于CRISPR的免提取一步检测技术(ExCad)，并提供用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法。本发明提供的用于检测肺炎链球菌的核酸分子包含用于检测肺炎链球菌的LAMP引物组、gRNA和ssDNA探针。所述核酸分子配合Cas12b蛋白，并进一步应用ExCad技术建立了基于CRISPR的一步肺炎链球菌检测方法(ExCad‑Sp)，还构建了肺炎链球菌检测试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作简便，可实现特异、灵敏、快速、准确的肺炎链球菌检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR的免提取一步检测技术(ExCad)，以及用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法。

背景技术

近来，新兴的基于成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)的核酸检测技术备受关注，被誉为2022年值得关注的七大技术之一。这些基于CRISPR的检测技术基于一些CRISPR相关(Cas)的效应分子(如Cas12a、Cas12b、Cas13a和Cas14)的反式切割(侧切)活性，并已成功应用于检测多种病原体和小分子。RNA引导的靶向DNA的Cas12和RNA引导的靶向RNA的Cas13已被用于开发新型核酸检测平台，例如，DETECTR、SHERLOCK或HOLMES检测平台。在这些检测平台中，基于CRISPR的检测与核酸扩增相结合，具有很高的特异性和敏感性。

但到目前为止，在大多数CRISPR介导的核酸检测平台上，靶标预扩增和基于CRISPR的检测是两个独立的步骤，即预扩增后需要打开反应管盖，手动将预扩增产物转移到Cas检测体系中，再进行下一步的CRISPR检测——这导致了更繁琐的人工操作和潜在的交叉污染风险。一些基于CRISPR的检测平台改进了CRISPR辅助的单管内检测，但仍然需要离心和混合步骤。此外，为了确保Cas酶的高效工作，通常需要在合适的位置设置一个原间隔子相邻基序(PAM)序列，这是阻碍基于CRISPR检测方法应用的一个局限，因为目标序列中可能没有合适的PAM位点。CRISPR-top技术是一种一步一锅的基于CRISPR的核酸检测平台，它将环介导等温扩增(LAMP)与基于CRISPR/Cas12b的检测在一个反应管中结合，最大程度上避免了交叉污染。此外，在CRISPR-top法中，将Cas12b的一个标准PAM序列人工插入到前向内引物(FIP)的连接区，通过LAMP预扩增将PAM位点引入靶标，从而扩大了该技术的应用范围。然而，在CRISPR-top应用过程中，我们发现在某些情况下很难设计出合适的FIP和向导RNA(gRNA)，尤其是对于AT-rich序列。在基于CRISPR的检测中，不恰当的FIP会导致假阳性结果，我们推测是由于FIP发生自我折叠并形成了能够激活Cas12b的类gRNA结构，从而导致了假阳性结果。此外，CRISPR-top分析需要DNA/RNA提取步骤，这使得检测过程复杂化，并阻碍了该方法在无实验室条件下的应用。痰作为一种非侵入性样本类型，易于获得，对呼吸道疾病的诊断较为可靠。但由于痰标本成分复杂、黏性大等特点，若不进行核酸提取，很难直接用于核酸检测。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)是导致社区获得性肺炎最主要的细菌病原体。目前，对于肺炎链球菌的临床诊断主要依赖于传统的分离培养技术，分离培养仍是肺炎链球菌感染临床诊断的金标准。但分离培养耗时长，且需要一定的临床检验经验并借助质谱仪或基因扩增测序等手段，因此不适合于快速检测和家庭自检。尽管荧光定量PCR技术已被应用于肺炎链球菌的检测并展现了良好的效果，但荧光定量PCR仪属于精密仪器，价格昂贵，因此荧光定量PCR法不但在家庭自检中难以实现，在其他条件有限的地区或场景中也难以应用。虽然恒温扩增法不依赖于精密仪器，但大量研究表明，单纯使用恒温扩增进行检测极易出现假阳性，导致误诊。目前，基于CRISPR检测肺炎链球菌的方法尚未被开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒，以及基于CRISPR的免提取一步检测技术(ExCad)建立的肺炎链球菌检测方法。