[发明专利]蓝点马鲛染色体核型图的制作方法

权利要求书

1.蓝点马鲛染色体核型图的制作方法，其特征在于，所述方法包括：1)获得蓝点马鲛仔稚鱼；2)仔稚鱼染色体制备；3)蓝点马鲛染色体核型分析；

所述的仔稚鱼染色体制备：捞取蓝点马鲛仔稚鱼，将仔稚鱼放入0.04％(g/ml)的秋水仙素溶液中，室温下静置30min；

秋水仙素处理仔稚鱼样品之后，弃秋水仙素溶液，将样品分成两份，分别放入浓度为0.05mol/L KCl和0.075mol/L KCl的低渗溶液中，低渗处理45～60min；

样品低渗结束后，弃去低渗溶液，加入固定溶液，4℃固定15min；固定液量使样品需完全浸入固定液；之后，弃去固定液，然后更换新的预冷的固定溶液，再次固定15min，样品固定均在4℃中进行，重复此固定步骤3～4次，样品固定充分；取1条仔稚鱼样品放入一个预冷的样品管中，样品管中加有0.5～1.5ml预冷的解离液，然后4℃下解离；

在解离过程中，摇晃或震动样品管壁或一次性滴管吹打解离液均可有效加速样品组织细胞的解离；解离液空气干燥法制片；

所述的蓝点马鲛染色体核型分析：从0.075mol/L KCl低渗液制备的染色体图片中获得染色体众数，确定染色体众数后，再从低渗溶液的浓度为0.05mol/L KCl获得的图片中选取染色体众数正确，且形态轮廓边界清晰，分散好的图片用于核型分析。

2.根据权利要求1所述的蓝点马鲛染色体核型图的制作方法，其特征在于，所述的0.04％(g/ml)的秋水仙素溶液中含有一半体积的无菌过滤海水。

3.根据权利要求1所述的蓝点马鲛染色体核型图的制作方法，其特征在于，在用0.04％(g/ml)的秋水仙素溶液处理蓝点马鲛仔稚鱼时，敞开容器盖。

4.根据权利要求1所述的蓝点马鲛染色体核型图的制备方法，其特征在于，在低渗期间，上下颠倒数次，确保低渗充分。

5.根据权利要求1所述的蓝点马鲛染色体核型图的制作方法，其特征在于，所述固定液为无水乙醇与冰醋酸的体积比为3：1；所述解离液为冰醋酸与蒸馏水体积比1：1。

6.根据权利要求1所述的蓝点马鲛染色体核型图的制作方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)选取10～20个染色体形态好分散好的中期分裂相放大打印，对每个分裂相上48条染色体进行随机编号1～48，用显眼的笔标记出每条染色体的着丝点以及长臂、短臂的末端，再用直尺量出长臂和短臂的长度，依次记录1～48短臂和长臂的测量值；

(2)将测量好的数值输入Excel表格，每个个体可输入1～5组数据，每组数据横向依次输入短臂、长臂，纵向依次输入1～48的编号，每组数据之间间隔至少一列；然后用Excel表格公式对应横向数据计算出每条染色体的染色体长度、臂比值和相对长度，然后根据臂比值确定染色体类型，再根据相对长度对所有的染色体进行从大到小的排序，排序依据选择扩展选定区域；

(3)查看每组染色体类型情况是否一致，以多数一致的类型为准，如果某组数据偏差太大则弃用，如果某组数据个别染色体数据出入较大，根据其序号核对测量数值是否输入有误或者测量有误或者着丝点定位不准来进行微调或修改；

(4)按照类型进行每组数据的排序微调，由于蓝点马鲛48条染色体属于二倍体，每组数据从大到小一对一对地进行相对长度和臂比值的平均值±标准误差的统计，最终确定蓝点马鲛染色体核型为2n＝48＝2sm+4st+42t；

(5)挑选一个染色体形态好且分散好的中期分裂相，用Photoshop对这个中期分裂相的图片进行拷贝，新建和这个图片一样大小的画布；然后对A4纸上排序为1-48的染色体依次进行拷贝并粘贴至新建的画布上，点击编辑按钮下拉菜单中的变换，选择旋转按钮，把拷贝的染色体旋转成短臂在上长臂在下的状态；用橡皮工具擦除染色体轮廓之外的部分，仅保留染色体形态；然后在Excel表格中根据相对长度实际值和臂比值进行从大到小从m到sm到st到t的顺序进行排序，染色体核型图片即完成。