[发明专利]一种色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法

说明书

本发明涉及一种色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法及其应用。具体步骤包括：S1.孵育目标细胞；S2.对照培养；S3.kynurenine配制梯度标准液；S4.对目标细胞和梯度标准液进行显色，检测。本发明通过特定培养基和培养工艺条件的控制，解决了IDO1检测方法普遍存在的数据偏差较大的缺陷；能够在短时间内快速检测间充质干细胞吲哚胺2，3‑双加氧酶1（IDO1）的活性，并获得稳定可信的数据，大幅提升了人间充质干细胞IDO1活性的检测效率；同时本方法操作便捷，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法及其应用。

背景技术

吲哚胺2,3-双加氧酶1(indoleamine2,3-dioxygenase1, IDO1)是介导色氨酸沿犬尿氨酸途径的限速酶，通过降解色氨酸营造色氨酸饥饿环境及产生代谢产物来调节肿瘤免疫，是潜在的肿瘤免疫治疗药物靶点。目前对于IDO1活性的检测主要通过检测色氨酸或其代谢产物（如甲酰犬尿氨酸、犬尿氨酸）来实现。现有技术中较为成熟的测定手段主要有以下几种：1. 高效液相色谱法（HPLC）：高效液相色谱法检测IDO1活性在1990年由Beal MF等人首次提出，通过检测由色氨酸及降解产生的犬尿氨酸的含量来测定IDO1酶的活性。该法准确度高，进样量少，特异性好，不受其他物质的干扰，不足之处在于针对不同的样本中需要设置不同的实验条件以减少拖尾峰，改善峰形，普适性较差；2. 吸光度测定：Tamantha等人基于Takikawa的理论提出了吸光度检测法。该法需要临时配制混合IDO1酶反应体系，通过用酶标板检测产物犬尿氨酸与对二甲氨基苯，即p-DMAB反应生成的络合物的吸光度来确定IDO1酶的活性；该方法简单便捷，但对反应溶液的新鲜程度要求很高，需要现用现配（尤其是抗坏血酸和过氧化氢酶），为实际应用带来了不便；3. 荧光检测：荧光检测的对象既可以直接选择甲酰犬尿氨酸或水解后的犬尿氨酸。甲酰犬尿氨酸是色氨酸由IDO1酶催化的直接产物，选择性较高，但由于甲酰犬尿氨酸本身激发波长短，容易猝灭，需要使用哌啶进行衍生化；荧光法灵敏度高，用量少，可用于酶标进行高通量筛选IDO1酶抑制剂，但该法需要用到pH＝1的强酸和pH＝11的强碱，且哌啶有刺激性气味，危险系数较高，限制了其在临床领域广泛应用。

中国专利CN202011561297.0公开了一种满足产品放行要求的免疫调节干细胞IDO1活性检测方法，采用含有/不含IFN-γ的培养基作用于待检测的供试品，检测供试品的相对生物学活性，CN201680053185.X公开了一种用于鉴定IDO1和/或TDO调节剂的筛选测定法，采用520-560nm的荧光测量与犬尿氨酸感受器接触后的细胞IDO1表达。现有技术中对人间充质干细胞IDO1活性的检测精密度较低，现行业的RSD标准为≤20%即为合格，对于数据质量的提升处于瓶颈突破阶段。本发明探究一种准确度高、简单便捷、安全实用的IDO1检测方法，使数据RSD降低至10%以下，数据质量大幅提升，有效推动了IDO1活性评估方法的准确性。

发明内容

本发明通过提供一种色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法，解决了现有技术对于人间充质干细胞IDO1活性的检测效率较低、检测结果不够准确的缺陷，实现了一种准确度高、简单便捷、安全实用的色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法。

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种色氨酸代谢限速酶活性的快速评估方法，具体步骤包括：

S1. 孵育目标细胞；

S2. 采用第一培养基和第二培养基对孵育后的目标细胞进行对照培养；

S3. 配制kynurenine（犬尿氨酸）梯度标准液；

S4. 对S2步骤中对照培养后的目标细胞和kynurenine梯度标准液进行显色，检测；

所述第一培养基和第二培养基的区别在于：第一培养基中不含有γ干扰素，第二培养基中含有γ干扰素。