[发明专利]一种PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR同步检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明申请是关于一种PEMV‑1和PEMV‑2的RT‑PCR同步检测试剂盒及检测方法，基于一步法多重RT‑PCR检测方法，属于植物保护领域。本发明通过设计PEMV‑1、PEMV‑2两种病毒的特异性检测引物，并采用CTAB法提取染病样品总核酸作为模板，利用一步法多重RT‑PCR技术实现对PEMV‑1、PEMV‑2两种病毒的同步检测。通过对反应体系和反应条件的优化，该方法可以高效、快速、准确地实现对PEMV‑1、PEMV‑2两种病毒的特异性检测，较传统RT‑PCR检测方法一次只能检测单一病毒更具高效性，且显著降低了检测成本，极大地节约了检测时间。

技术领域

本发明申请涉及植物保护领域，具体涉及同步检测PEMV-1和PEMV-2的方法及其试剂盒的组装。

背景技术

豌豆耳突花叶病毒1号(pea enation mosaic virus 1，PEMV-1)常与豌豆耳突花叶病毒2号(pea enation mosaic virus 2，PEMV-2)复合侵染引起豌豆耳突花叶病，病毒侵染豌豆后症状表现为植株生长扭曲，发育迟缓，花叶，叶片黄化并有坏死斑，叶脉褪绿，叶片皱缩、卷曲，在叶背及豆荚上有时会有耳状突起，病株的豆荚常畸形，结实率显著降低。PEMV-1和PEMV-2这两种病毒往往同时存在于同一寄主植物中，因此最早的报道中认为PEMV-1与PEMV-2是同一种病毒的两个RNA组分，后来通过对PEMV-1和PEMV-2的基因组RNA进行详细分析，发现PEMV-1与PEMV-2是两种不同的病毒，PEMV-1归属于耳突花叶病毒属(Enamovirus)，PEMV-2则属于幽影病毒属(Umbravirus)。近年来，PEMV-1、PEMV-2陆续在云南省的多种作物上被检测出来，这2种病毒经常发生复合侵染。虽然PEMV-1和PEMV-2引起的病毒病目前尚未在我国大面积流行，但一旦爆发将会影响豌豆、蚕豆乃至其他作物正常的生长发育，造成严重的损失。因此，加强对PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制显得尤为重要。但对PEMV-1与PEMV-2的检测至少需要进行两次RT-PCR才可完成，检测过程耗时长，检测成本高。为此，建立一种PEMV-1与PEMV-2同步检测体系，用一步法RT-PCR同时检测出一个样品中所含有的两种病毒，不仅能大大缩短检测时间，节约检测成本，而且能为PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制提供强有力的技术支撑。

发明内容

为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供一种PEMV-1和PEMV-2的RT-PCR同步检测试剂盒及检测方法，提高PEMV-1与PEMV-2的检测效率，为PEMV-1与PEMV-2引起的豌豆耳突花叶病的监测、预防和控制提供技术支撑。

本发明申请第一方面提供了引物组合，包括第一引物组合和/或第二引物组合；

所述第一引物组合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(III).如(I)、(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个至10个；或

(IV).与(I)、(II)、(III)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或

所述第二引物组合，具有：

(I).上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

(II).下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或

(III).如(I)、(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个至10个；或