[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株、构建方法及其应用

说明书

本发明提出一种基于CRISPR‑Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株、构建方法及其应用，属于微生物基因工程领域，能够解决由于Lager酵母的异源、高度染色体倍性及其基因组不稳定性等限制因素，导致CRISPR‑Cas9系统难以在Lager酵母中应用的技术问题。其中，本发明基于CRISPR‑Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株命名为TT01‑ΔFLO1和TT02‑ΔFLO1，拉丁文名均为巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)，保藏编号分别为CGMCCNo.25620和CGMCCNo.25621，均于2022年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该FLO1基因缺失突变菌株为利用CRISPR‑Case9系统将Lager酵母的功能基因FLO1敲除后获得的工程菌株。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株、构建方法及其应用。

背景技术

Lager型啤酒酵母(Saccharomyces pasteurianus)全基因组测序结果表明该酵母为异源多倍体杂交种，其中一个亲本为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，另一个亲本为真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)。不同于酿酒酵母，工业Lager酵母菌株是一种具有高度染色体倍性、染色体结构组成复杂的异源多倍体酵母菌株。由于Lager酵母在不同的工业环境中经过了长期使用及不断驯养，导致菌株的基因组都发生不同程度的改变，从而衍化出了工业Lager酵母菌株的特殊性、复杂性以及杂交菌株的基因组不稳定性。

在酵母诸多性能中，絮凝性是贯穿啤酒发酵过程始终的一项极其重要的性能指标，在发酵各个阶段，酵母细胞数都应保持在相对稳定的范围内，才能保证啤酒生产的正常运行，进而保证发酵的一致性和产品口味质量的稳定性，因此酵母的絮凝性与酵母表现出的发酵性能、代谢产物的生成和还原等生化反应息息相关，在啤酒酿造过程中酵母絮凝性能的异常波动会严重影响产品的口味和生产效率。

酿酒酵母(S.cerevisiae)的絮凝性是由其遗传背景决定的。参与絮凝蛋白的表达的基因有多个(例如，FLO1，FLO2，FLO4，FLO5，FLO8，FLO9，FLO10，FLO11等)，形成了絮凝蛋白基因家族。由于絮凝基因中含有大量的重复片段，研究发现FLO1基因中这些重复片段的重复次数直接影响酿酒酵母絮凝性的强弱。絮凝基因越长，重复片段的重复次数越高，酵母的絮凝性越强，但是FLO1基因对Lager酵母絮凝性的影响目前尚无直接证据。

基因编辑技术(或称“基因敲除、敲减或过表达、敲入”)是基因功能研究常用策略，成簇规律间隔性短回文序列(Cluster regularly interspaced short palindromerepeats，CRISPR)技术因操作简便、快速、高效，无种属限制，成为基因功能研究热点和常用工具。该编辑系统已广泛应用于酿酒酵母中，但由于Lager酵母的异源、高度染色体倍性及其基因组的不稳定性使CRISPR-Cas9系统难以在Lager酵母开展应用。

发明内容

本发明针对由于Lager酵母的异源、高度染色体倍性及其基因组不稳定性等限制因素，导致CRISPR-Cas9系统难以在Lager酵母中应用的技术问题，对异源、高度染色体倍性的Lager酵母进行基因编辑，并进一步明晰FLO1基因缺失对Lager酵母絮凝性的影响，建立了一种通过质粒改造对Lager酵母FLO1基因进行编辑的方法，并得到一株基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，所述FLO1基因缺失突变菌株命名为TT01-ΔFLO1，拉丁文名为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)，保藏编号为CGMCCNo.25620，于2022年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。