[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突变菌株命名为TT01-ΔFLO1，拉丁文名为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)，保藏编号为CGMCC No.25620，于2022年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突变菌株命名为TT02-ΔFLO1，拉丁文名为巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)，保藏编号为CGMCC No.25621，于2022年08月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突变菌株为利用CRISPR-Cas e9系统将Lager酵母的功能基因FLO1敲除后获得的工程菌株。

4.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，通过以下方法构建得到：

特异性sgRNA设计与合成：以FLO1基因作为sgRNA靶点选择，根据NCBI数据库中酿酒酵母S288C基因序列设计并合成如SEQ ID NO:1所示的特异性靶序列sgRNA；

重组质粒构建：构建含有所述特异性靶序列sgRNA的重组质粒，并对阳性克隆进行准确性验证后备用；

FLO1突变序列左右同源臂构建：根据所述FLO1基因设计如SEQ ID NO:5-8所示的引物组，分别用于扩增左侧同源臂和右侧同源臂，得到上下游扩增产物；

FLO1突变序列左右同源臂融合：以所述上下游扩增产物为模板进行巢氏PCR反应，所得融合PCR产物经纯化及测序验证后，即为融合FLO1突变序列；

重组质粒和融合FLO1突变序列转化：将经准确性验证的阳性克隆和融合FLO1突变序列转化至酵母感受态细胞中，依次经过平板涂布与培养、测序验证后，得到所述FLO1基因缺失突变菌株。

5.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，所述重组质粒构建步骤中，所用质粒为pUDP004，准确性验证包括PCR验证和测序验证；

其中，PCR验证所用引物为P-FLO1-FW和P-FLO1-RV2，其序列分别如SEQ ID NO:2-3所示，测序验证所用引物为pUDP004-test，其序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系统的FLO1基因缺失突变菌株，其特征在于，所述FLO1突变序列左右同源臂构建步骤中，PCR反应扩增条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸15s；(3)72℃延伸10min，4℃保持；其中，步骤(2)共30个循环；

所述巢氏PCR反应包括第一轮PCR反应和第二轮PCR反应，其中，第一轮PCR反应以所述上下游扩增产物为模板，不外加引物进行PCR扩增反应，得到一轮扩增产物，所述第二轮PCR反应以一轮扩增产物为模板进行PCR扩增反应；

所述第一轮PCR反应的反应条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s，57℃退火4min，72℃延伸30s；(3)72℃延伸10min，4℃保持，其中，步骤(2)共30个循环；

第二轮PCR反应的反应条件为：(1)98℃预变性30s；(2)98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s；(3)72℃延伸10min，4℃保持，其中，步骤(2)共30个循环；

所述重组质粒和融合FLO1突变序列转化步骤中，所用平板为乙酰胺选择性培养基。

7.用于构建FLO1基因缺失突变菌株的特异性靶序列sgRNA，其特征在于，其序列如SEQID NO:1所示。