[发明专利]缺失CPSⅡ和OMPDC基因的弓形虫减毒活疫苗

说明书

本发明公开了一种缺失CPSⅡ和OMPDC基因的弓形虫减毒活疫苗，该疫苗虫株由于敲除了cpsⅡ和ompdc两个基因，与出发虫株相比，彻底阻断了弓形虫尿苷酸(UMP)的从头合成途径，胞内增殖能力显著下降，具有几乎无毒力的优点，对宿主具有极高的安全性，可用于预防弓形虫的急慢性及先天性感染，因此该疫苗虫株有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及缺失CPSⅡ和OMPDC基因的弓形虫减毒活疫苗。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma.gondii)是一种人畜共患的专性细胞寄生原虫，可以感染几乎所有的温血动物。人和动物主要由于误食被弓形虫包囊、卵囊污染的肉类或水质而感染，当机体免疫功能正常时，一般呈隐形感染，无明显的临床症状；当孕妇及免疫缺陷的人感染刚地弓形虫则会造成较严重的后果，严重威胁人类的生命健康。弓形虫感染对畜牧业生产养殖业也有重大经济影响，弓形虫感染可能会导致猪、羊等流产、死胎，含有包囊的肉制品也是对人类健康的潜在威胁。

临床上使用已胺嘧啶和磺胺嘧啶联用治疗弓形虫病，但对包囊治疗效果不佳，因此，亟需开发弓形虫病疫苗。

然而，DNA、重组蛋白等亚单位疫苗仅能产生极低的部分免疫保护效果且处于科研阶段，目前市场上唯一的商品化弓形虫疫苗是从羊流产死胎中分离得到的弓形虫S48株，但是该疫苗存在着毒力返强的风险，并不是很适用于畜牧业养殖中。因此，开发具有较高安全性和有效性的弓形虫弱毒活疫苗具有重要意义。

尿苷酸(UMP)是所有其他嘧啶核苷酸的前体，是组成RNA的重要核苷酸之一。乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(OMPDC)是弓形虫尿苷酸从头合成途径的最后一个关键酶，弓形虫体内尿苷酸含量不足则会引起严重的遗传损伤，使得弓形虫丧失复制的能力，进而影响其毒力。然而，单缺失OMPDC虫株存在体外培养时虫株仍能增殖的缺点(噬斑实验)，可能存在返毒的风险(BA Fox,DJ Bzik,Avirulent Uracil Auxotrophs Based on Disruption ofOrotidine-5′-Monophosphate Decarboxylase Elicit Protective Immunity toToxoplasma gondii,Infection and Immunity,Vol.78,No.9,September 2010)。公开号为CN111388659A的发明申请公开了一种非复制型弓形虫在作为和/或制备禽用免疫增强剂方面中的应用，其中的非复制型弓形虫为将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶基因(OMPDC)和尿嘧啶核苷磷酸化酶基因(UP)进行双敲除而获得的非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫。但是该技术方案中是将OMPDC和UP基因双敲除后的非复制型弓形虫制成禽用免疫增强剂，用于增强新城疫弱毒疫苗的免疫效果。

公开号为CN108434447A的发明申请公开了一种预防弓形虫感染的减毒活疫苗，该疫苗含有同时缺失了乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(OMPDC)和乳酸脱氢酶1基因(LDH1)的弓形虫疫苗虫株。但该现有技术中使用的出发虫株ME49是球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种缺失CPSⅡ和OMPDC基因的弓形虫减毒活疫苗。

一种弓形虫疫苗虫株，是通过基因敲除技术获得了同时缺失氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ基因和乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因。其中，氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。优选的，基因敲除时使用的出发弓形虫为I型虫株。更优选的，基因敲除时使用的出发弓形虫为RH毒株。

其中使用的基因敲除的方式可以是CRISPR/Cas9方法，也可以是其他的基因敲除方法。

本发明又提供了所述弓形虫疫苗虫株在制备弓形虫减毒活疫苗中的应用。