[发明专利]运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用

说明书

本申请公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用。该基因工程菌株是将ZM4‑Cas12a菌株中pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒敲除得到的菌株。该基因工程菌株ZMNP获得了一种精简的基因组，减少能量消耗，并且具有一系列的优良性状，如转化效率高、更加耐受抑制物、对二次母液的利用能力更好等优异性能，十分适合作为工业微生物的底盘细胞。

技术领域

本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及运动发酵单胞菌的基因工程菌株。

背景技术

生物产业作为一种绿色、可持续发展的现代化制造方式不仅有效缓解资源能源短缺、环境弱化等全球面临的压力，而且是生物经济的重要组成部分，是减少化石燃料的依赖、能源和资源消耗、以及创造绿色就业机会和促进可持续发展的主要动力。生物产业发展的核心与关键是建立优良的菌种资源。目前，已经在多种微生物中通过菌株改造赋予其优良特性，实现多种化合物的产品生产。微生物基因组精简优化是构建优良底盘细胞的重要策略，对基因组中非必需的编码区域和非编码区域进行大规模的删减，得到“最小基因组”，通过敲除冗余基因减少细胞能耗，使更多的能量用于产品生产。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前唯一已知能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(Entner-Doudoroff，ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性；近年来被作为纤维素类生物质生物炼制生产生物能源的细胞工厂受到重视天然产乙醇菌株，目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2-3丁二醇，异丁醇,PHB等产品的生产。相比于模式微生物酿酒酵母(12.12Mb)和大肠杆菌(5.15Mb)，运动发酵单胞菌(2.14Mb)有基因组小的优势，便于开展基因组精简优化，是一个理想的工业微生物底盘细胞。然而，由于其某些内源性质粒的不必要表达而造成运动发酵单胞菌最为微生物底盘细胞进行发酵而造成负面的影响，不利于提高其对抑制物的耐受性和对底物的利用能力。

发明内容

为此，本申请发明人通过基因组测序发现，显示ZM4的基因组包括4个内源质粒：pZM32，32791bp；pZM33，33006bp；pZM36，36494bp和pZM39，39266bp)，内源质粒大小占据了总基因组大小的6.43％，且ZM4菌株内四个内源质粒的拷贝数在厌氧条件下的数量在1-2个，在有氧条件下的数量为在1～6个。本申请以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株的四个内源质粒进行消除，得到无内源质粒的菌株ZMNP。建立的基因工程菌株ZMNP获得了一种精简的基因组，减少能量消耗，并且具有一系列的优良性状，如转化效率高、更加耐受抑制物、对二次母液的利用能力更好等优异性能，十分适合作为工业微生物的底盘细胞。为此，本申请至少公开了如下技术方案：

第一方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是在ZM4-Cas12a菌株中敲除pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒得到的菌株。

第二方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株是在ZM4-Cas12a菌株中敲除pZM32、pZM36、pZM33、pZM39四个内源性质粒得到的菌株；

所述构建方法包括：

构建用于靶向消除的pZM32和pZM36的第一编辑质粒，构建靶向消除pZM33的第二编辑质粒，构建靶向消除pZM39的第三编辑质粒，构建用于替换pZM39上的毒素-抗毒素系统基因的第四编辑质粒，构建靶向消除Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒；

将所述第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a菌株；