[发明专利]运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用

权利要求书

1.一种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将ZM4-Cas12a菌株中四个内源性质粒pZM32、pZM36、pZM33、pZM39消除，并靶向消除Cas12a和壮观霉素基因得到的菌株ZMNP；

其中，所述ZM4-Cas12a菌株是将来源于弗朗西斯菌（F. novicida）的核酸酶Cas12a基因和壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4 ATCC3182菌株基因组ZMO0038位点，并采用诱导型启动子Ptet来控制Cas12a表达，构建得到的重组菌株；pZM32的Genbank编号为CP023678，pZM33的Genbank编号为NZ_－P023679，pZM36的Genbank编号为CP023680，pZM39的Genbank编号为CP023681。

2.一种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株是将ZM4-Cas12a菌株中四个内源性质粒pZM32、pZM36、pZM33、pZM39消除，并靶向消除Cas12a和壮观霉素基因得到的菌株ZMNP；其中，所述ZM4-Cas12a菌株是将来源于弗朗西斯菌（F. novicida）的核酸酶Cas12a基因和壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4 ATCC3182菌株基因组ZMO0038位点，并采用诱导型启动子Ptet来控制Cas12a表达，构建得到的重组菌株；pZM32的Genbank编号为CP023678，pZM33的Genbank编号为NZ_－P023679，pZM36的Genbank编号为CP023680，pZM39的Genbank编号为CP023681；

所述构建方法包括：

构建用于靶向消除的pZM32和pZM36的第一编辑质粒，构建靶向消除pZM33的第二编辑质粒，构建靶向消除pZM39的第三编辑质粒，构建用于替换pZM39上的毒素-抗毒素系统基因的第四编辑质粒，构建靶向消除Cas12a和壮观霉素基因的第五编辑质粒；其中，所述第一编辑质粒和所述第二编辑质粒采用CRISPR-Cas12a基因编辑系统构建，所述第三编辑质粒采用Zymomonas mobilis 内源CRISPR-IF型基因编辑系统构建；

其中，所述第四编辑质粒的构建方法包括：提取ZM4基因组，以ZM4基因组为模板，扩增同源臂，包括ZMOp39×020上游1kb的US和ZMOp39×023下游1kb的DS序列，扩增US的引物如SEQ ID NO.11~12所示，扩增DS的引物如SEQ ID NO.13~14所示；从具有氯霉素抗性的pEZ15A质粒上扩增氯霉素基因，并胶回收，扩增氯霉素抗性基因的引物如SEQ ID NO.15~16所示；从pUC57质粒上扩增Ori序列，并胶回收，扩增Ori序列的引物如SEQ ID NO.17~18所示；通过Overlap PCR，将US、氯霉素基因和DS片段连接成一个长片段，并通过胶回收得到US片段、氯霉素基因和DS片段连接产物；将所述Ori序列与所述US片段、氯霉素基因和DS片段连接产物用T5外切酶处理，并转化到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒；

所述第五编辑质粒的构建方法包括：将如SEQ ID NO.19~20所示的向导引物序列连接到含有CRISPR-ⅠF表达单元的氯霉素编辑质粒载体上，得到靶质粒；采用如SEQ ID NO.21所示的Cas12a-US-F和如SEQ ID NO.22所示的Cas12a-US-R扩增靶基因上游1kb序列，采用如SEQ ID NO.23所示的Cas12a-DS-F和如SEQID NO.24所示的Cas12a-DS-R扩增靶基因下游1kb序列，采用如SEQ ID NO.25所示的0038-F和如SEQ ID NO.26所示的0038-R扩增ZMO0038基因序列，通过PCR分别扩增其DNA片段，再通过OverlapPCR获得所述上游1kb序列、所述ZMO0038基因序列和所述下游1kb序列连接在一起的片段；将所述靶载体利用如SEQ IDNO.27~28所示的引物进行反向PCR扩增，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证，验证正确得到第五编辑质粒；

将所述第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a菌株中，得到pZM32和pZM36消除的ZM4-Cas12a∆32∆36菌株；

将所述第二编辑质粒转入pZM32和pZM36消除的所述ZM4-Cas12a∆32∆36菌株中，得到pZM32、pZM36和pZM33消除的ZM4-Cas12a∆32∆33∆36菌株；

将所述第四编辑质粒转入pZM32、pZM36和pZM33消除的所述ZM4-Cas12a∆32∆33∆36菌株，得到pZM39上的毒素-抗毒素系统基因替换为抗性基因的ZM4-Cas12a∆32∆33∆36∆TA::Cm菌株；

将所述第三编辑质粒转入至所述ZM4-Cas12a∆32∆33∆36∆TA::Cm菌株中，得到pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的菌株ZMNP-Cas12a；

将所述第五编辑质粒转入pZM32、pZM36、pZM33和pZM39四个内源性质粒消除的所述ZMNP-Cas12a菌株中，替换Cas12a和壮观霉素基因，得到所述基因工程菌株ZMNP。