[发明专利]一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法

说明书

本发明利用RPA‑LDR‑qPCR技术，建立了一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法。本发明将RPA检测技术代替PCR技术，使检测时间大大缩短，且不使用昂贵的PCR仪，在常温条件下即可实现核酸扩增。以RPA‑LDR‑qPCR技术作为MTHFR C677T基因多态性分型检测具有高灵敏度、特异性强等优点。

技术领域

本发明属于基因多态性检测技术领域，具体是指一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法。

背景技术

叶酸，又称维生素B9。叶酸在DNA合成、DNA甲基化等方面发挥重要的作用，与胚胎正常发育、健康维持以及多种疾病的风险有关，是细胞增殖、组织生长与机体发育不可缺少的营养素。一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或间接地导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心血管疾病的发生。

目前，经验证MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)是与叶酸代谢密切相关的基因，主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，甲基化后的叶酸具有生物活性，可以被人体使用。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。因此，MTHFR基因一旦发生缺陷，将导致机体多个基础生化过程(包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等)的紊乱，进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。

在精准医疗时代，单核苷酸多态性(SNP)分型是诊断各种病理的有价值的工具。MTHFR基因多态性分型是叶酸代谢相关疾病精准医疗的基础。目前，有关SNP分型的技术有很多种，包括直接测序法、限制性片段长度多态性分析法、荧光定量PCR技术(qPCR)、分子信标等技术。然而，这些方法都有一定的局限性，如假阳性率高、耗时费力和对样本要求高等问题。另外，临床常用的MTHFR基因多态性分型方法是PCR-荧光探针法，其检测限为200copies/μL，灵敏度不足，且对样本要求较高。因此需建立一种灵敏度高的MTHFR基因多态性分型检测方法。连接酶链反应(LDR)是近年来开发出的一种基于高温连接酶检测基因分型的新方法。海洋嗜热菌Thermus aquaticus高温连接酶一旦检测到DNA与互补的2条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，反之则可以进行连接反应。重组酶聚合酶扩增(RPA)技术较PCR技术具有更快速简便的优点。本发明为临床检测相关单碱基突变提供一种新的快速、高效、特异性的分子诊断方法，应用于MTHFR基因多态性分型。

发明内容

本发明利用RPA-LDR-qPCR技术，用于MTHFR C677T基因多态性分型检测。

本发明提供一种MTHFR C677T基因多态性分型检测方法，包括以下步骤：

(1)利用特异性扩增引物1和引物2，使用RPA反应体系扩增该位点的野生型片段或突变型片段；

(2)利用特异性扩增引物3、4和5，使用LDR反应体系对步骤(1)扩增产物进行处理；

(3)利用特异性扩增引物6和7，使用qPCR反应体系对步骤骤(2)的反应产物判别基因分型结果；

在一些实施方案中，步骤(1)所述引物序列如下：

引物1：CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGT；

引物2：TGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCAC。

在一些实施方案中，步骤(2)所述引物序列如下：

引物3：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGG；

引物4：CGGTTTTGGCGCAGTGACGCTGCGTGATGATGAAATCGA；