[发明专利]人源化胶原蛋白制备工艺

说明书

本发明公开了一种人源化胶原蛋白制备工艺，包括如下步骤：A.将毕赤酵母菌种液、接种到灭菌的发酵培养基中放入发酵罐中进行培养；B.待发酵结束后，收集发酵液，对发酵液进行离心作业，利用离心作业收集菌体，然后将收集到的菌体进行破碎，待菌体破碎后再离心收集离心上清液；C.将步骤B中所得到的上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱后得到第一洗脱液；D.将步骤C中所得第一洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱后得到重组人源胶原蛋白。解决现有人源胶原蛋白生产时存在发酵周期过长，发酵水平较低，而且制备得到的重组人源胶原蛋白溶液的稳定性差，容易析出，重组人源胶原蛋白生物学活性难以长期保持的问题。

技术领域

本发明涉及人源胶原蛋白生产具领域，特别是一种人源化胶原蛋白制备工艺。

背景技术

人源胶原蛋白是利用基因工程技术，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。

现有的人源胶原蛋白在生产时，存在如下问题：发酵周期过长，发酵水平较低，而且制备得到的重组人源胶原蛋白溶液的稳定性差，容易析出，重组人源胶原蛋白生物学活性难以长期保持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源化胶原蛋白制备工艺，解决现有人源胶原蛋白生产时存在发酵周期过长，发酵水平较低，而且制备得到的重组人源胶原蛋白溶液的稳定性差，容易析出，重组人源胶原蛋白生物学活性难以长期保持的问题。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种人源化胶原蛋白制备工艺，包括如下步骤：A.将毕赤酵母菌种液、接种到灭菌的发酵培养基中放入发酵罐中进行培养；B.待发酵结束后，收集发酵液，对发酵液进行离心作业，利用离心作业收集菌体，然后将收集到的菌体进行破碎，待菌体破碎后再离心收集离心上清液；C.将步骤B中所得到的上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱后得到第一洗脱液；D.将步骤C中所得第一洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱后得到重组人源胶原蛋白。

首先，本发明优化了毕赤酵母的发酵工艺，解决了发酵周期过长，发酵水平较低的问题，其次本发明创造性的利用镍琼脂糖凝胶柱结合葡聚糖凝胶柱对重组人源胶原蛋白进行分离纯化，纯化工艺相对简单，得到的蛋白纯度较高；而且，本发明对纯化过程中使用的各种溶液的组分、浓度及pH进行优化，并且在得到的目的蛋白洗脱液中添加合适浓度的牛血清白蛋白和EDTA-2Na，得到重组人源胶原蛋白保存液，显著提高了重组人源胶原蛋白的稳定性，有利于重组人源胶原蛋白活性的长期保持。

作为本发明的进一步优选，所述步骤A中的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为CGMCCNo.5021。

作为本发明的进一步优选，所述步骤A中加入的毕赤酵母菌种液与发酵培养基的质量份数分别为毕赤酵母菌种液55-60份、发酵培养基550-600份。

作为本发明的进一步优选，所述步骤A中发酵罐中的发酵过程包括四个阶段，所述四个阶段依次分别为起始发酵阶段、补充甘油发酵阶段、甲醇诱导发酵阶段和最终稳定发酵阶段，所述起始发酵阶段时搅拌转速为200rpm、罐压为0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧＞30％，起始发酵阶段的pH值为控制在5.5；当碳源耗尽后，溶氧陡然上升时开始补充甘油发酵阶段，补充甘油发酵阶段开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时；甘油耗尽后开始甲醇诱导发酵阶段，甲醇诱导发酵阶段需要将pH值控制在5，甲醇诱导发酵阶段开始流加10％(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合液，调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧＞22％，甲醇诱导发酵阶段的时间为80h，80h后停止流加甘油-甲醇混合液进入最终稳定发酵阶段，最终稳定发酵阶段流加甲醇，最终稳定发酵阶段的时间为6h。