[发明专利]人源化胶原蛋白制备工艺

权利要求书

1.一种人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：A.将毕赤酵母菌种液、接种到灭菌的发酵培养基中放入发酵罐中进行培养；B.待发酵结束后，收集发酵液，对发酵液进行离心作业，利用离心作业收集菌体，然后将收集到的菌体进行破碎，待菌体破碎后再离心收集离心上清液；C.将步骤B中所得到的上清液过镍琼脂糖凝胶柱层析、洗脱后得到第一洗脱液；D.将步骤C中所得第一洗脱液过葡聚糖凝胶柱层析、洗脱后得到重组人源胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤A中的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为CGMCCNo.5021。

3.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤A中加入的毕赤酵母菌种液与发酵培养基的质量份数分别为毕赤酵母菌种液55-60份、发酵培养基550-600份。

4.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤A中发酵罐中的发酵过程包括四个阶段，所述四个阶段依次分别为起始发酵阶段、补充甘油发酵阶段、甲醇诱导发酵阶段和最终稳定发酵阶段，所述起始发酵阶段时搅拌转速为200rpm、罐压为0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧＞30％，起始发酵阶段的pH值为控制在5.5；当碳源耗尽后，溶氧陡然上升时开始补充甘油发酵阶段，补充甘油发酵阶段开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为214g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时；甘油耗尽后开始甲醇诱导发酵阶段，甲醇诱导发酵阶段需要将pH值控制在5，甲醇诱导发酵阶段开始流加10%（w/v）甘油含量的甘油-甲醇混合液，调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧＞22％，甲醇诱导发酵阶段的时间为80h，80h后停止流加甘油-甲醇混合液进入最终稳定发酵阶段，最终稳定发酵阶段流加甲醇，最终稳定发酵阶段的时间为6h。

5.根据权利要求4所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：在甲醇诱导发酵阶段向发酵培养基中加入柠檬三铵，其中柠檬三铵的加入量为0.1～10g/L。

6.根据权利要求4所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述甲醇诱导发酵阶段完成后向发酵罐中一次性添加0.2～0.5ML-赖氨酸或L-精氨酸。

7.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤A中的发酵培养基由如下原料制成85％H3PO426.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O14.9g/L；KOH4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L；丙酮酸钠0.5g/L。

8.根据权利要求1所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤B中离心收集菌体的速度为20-50L/h，转速为12000-18000rpm；将收集到的菌体进行破碎采用高压破碎，压力为800-1200bar；离心收集离心上清液时离心的转速为12000-16000rpm，离心的时间为30-50min。

9.根据权利要求8所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述离心收集离心上清液后清还须对上清液进行过膜；过膜时所述膜的尺寸为0.45μm。

10.根据权利要求8所述的人源化胶原蛋白制备工艺，其特征在于：所述步骤C中过镍琼脂糖凝胶柱层析前还包括用A液平衡镍琼脂糖凝胶柱，所述A液包括磷酸缓冲液、氯化钠和吐温80；

优选地，所述A液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07％的吐温80，所述A液的pH范围为6.0-7.5；

优选地，所述平衡镍琼脂糖凝胶柱是指平衡5-10个柱体积；

优选地，步骤C所述洗脱前还包括用B液洗杂蛋白，所述B液包括磷酸缓冲液、氯化钠、吐温80和咪唑；

优选地，所述B液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07％的吐温80和浓度为40-100mM的咪唑，所述B液的pH范围为6.0-7.5；

优选地，所述洗杂蛋白是指洗5-10个柱体积；

优选地，步骤C所述洗脱是指用C液洗脱，所述C液包括磷酸缓冲液、氯化钠、吐温80和咪唑；

优选地，所述C液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠、质量浓度为0.03-0.07％的吐温80和浓度为300-480mM的咪唑，所述C液的pH范围为6.0-7.5；

优选地，步骤C所述洗脱是指洗5-7个柱体积；

优选地，步骤D所述过葡聚糖凝胶柱层析前还包括用A’液平衡葡聚糖凝胶柱；

优选地，所述A’液包括浓度为15-25mM的磷酸缓冲液、浓度为0.15-0.25M的氯化钠和质量浓度为0.03-0.07％的吐温80，所述A’液的pH范围为6.0-7.5；

优选地，所述平衡葡聚糖凝胶柱是指平衡5-7个柱体积；

优选地，步骤D所述过葡聚糖凝胶柱层析是指将步骤C所得洗脱液上样葡聚糖凝胶柱，上样体积为葡聚糖凝胶柱体积的15-25％；

优选地，步骤D所述洗脱是指用A’液洗脱一个柱体积。