[发明专利]基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法

说明书

本发明提供了一种基于PCR‑RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法，本发明通过分析禾谷镰刀菌及其近缘种在Tri1基因序列上的差异，获得了NX型禾谷镰刀菌特异性的SNP位点，设计了相应的限制性内切酶；即以禾谷镰刀菌基因组DNA为模板，分别利用设计开发的两组引物组合，扩增其Tri1基因部分序列；将PCR产物进行纯化后使用限制性内切酶NheI或BclI进行酶切；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳结果观察；本发明操作简便、重复性好，特异性高，通过条带数量准确鉴定出NX型的禾谷镰刀菌菌株，为基础农业技术人员、科研人员及检验检疫单位开展NX型禾谷镰刀菌鉴定、预测预报和防治、海关检疫提供了一种新的便利方法。

技术领域

本发明属于镰刀菌产毒基因型鉴定技术领域，具体涉及一种基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法。

背景技术

小麦赤霉病是一种严重的植物病害，被称为小麦的“癌症”，在世界范围内广泛流行。禾谷镰刀菌是引起世界范围内小麦赤霉病的主要病原菌，危害极其严重。

除了造成严重的产量损失，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)可以产生多种真菌毒素，威胁人畜健康。其中，以单端孢霉烯毒素危害最为普遍，已成为影响粮食生产和食品安全的重大隐患。之前的研究认为，禾谷镰刀菌只能产生B类单端孢霉烯毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，以及DON的乙酰化产物3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3A-DON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15A-DON)。3A-DON型、15A-DON型和NIV型禾谷镰刀菌被统称为B型禾谷镰刀菌。

然而，近年来发现了一种可以产A类单端孢霉烯毒素的禾谷镰刀菌菌株，该类禾谷镰刀菌被称为NX型菌株，其产生的A类单端孢霉烯毒素被命名为NX毒素(Varga,E.；Wiesenberger,G.；Hametner,C.；Ward,T.J.；Dong,Y.；D.；McCormick,S.；Broz,K.；Stückler,R.；Schuhmacher,R.；Krska,R.；Kistler,H.C.；Berthiller,F.；Adam,G.Newtricks of an old enemy:Isolates of Fusarium graminearum produce a type Atrichothecene mycotoxin.Environ.Microbiol.2015,17(8),2588–2600.)。NX型禾谷镰刀菌群体的出现给小麦生产、食品安全带来了新的严峻挑战。深入系统开展NX型禾谷镰刀菌鉴定技术、种群分布特征、产毒机理研究是当前面临的新的科学问题。然而，由于目前尚无商品化的NX毒素标准品可以获得，给谷物NX毒素污染风险评估、NX型菌株群体分布研究带来了困难。因此亟待开发相关的分子鉴定方法，为农业生产、检验检疫等提供便利。

明确危害小麦禾谷镰刀菌的产毒类型对开展病害流行、防控及真菌毒素污染风险评估具有重要意义。传统方法是对禾谷镰刀菌进行培养后提取毒素，然后进行色质谱分析，通过化学检测明确菌株的产毒类型。然而，传统方法具有周期长、需要使用毒素标准品(目前尚无商品化的NX毒素标准品可以获得)、需要配置价格昂贵的大型色质谱仪器设备等缺点。因此，基于DNA序列多态性，开发禾谷镰刀菌产毒基因型快速鉴定方法，对进行小麦等谷物中真菌毒素污染风险评估及有针对性地开展病害及毒素污染防控工作具有重要意义。

因此，非常有必要建立准确鉴定NX型禾谷镰刀菌的技术体系，为农业生产、病害防治和科学研究提供技术支持。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，发明人开展了大量的前期研究工作，成功开发了两组基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的方法，实现了技术突破。相较于传统的化学分析技术，该分子鉴定方法具有成本低、安全性高、通量高、速度快、不需要购置昂贵的色质谱仪器等诸多优点。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：