[发明专利]基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物及方法

权利要求书

1.一种基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的引物，其特征在于：所述引物包括：

NX-Tri1F：5′-AACACTACCTCGGTGCTAACA-3′（SEQ ID NO. 1），

NX-Tri1R1：5′-ACTCTCCTGATCTCTTCCTGC-3′（SEQ ID NO. 2），

NX-Tri1R2：5′-CACTCGTAGTTGAGCAAAAGG-3′（SEQ ID NO. 3）。

2.一种基于PCR-RFLP快速鉴定NX型禾谷镰刀菌的方法，其特征在于：其包括如下步骤：

（1）、以NX型禾谷镰刀菌基因组DNA为模板扩增Tri1基因的部分序列得到扩增基因片段，所用引物为权利要求1所述序列的引物；

（2）、使用琼脂糖凝胶回收试剂盒或PCR产物回收试剂盒对步骤（1）所得扩增产物进行回收纯化；

（3）、对步骤（2）所得纯化产物进行酶切；

（4）、将步骤（3）所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对结果进行分析和判定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述禾谷镰刀菌基因组DNA的浓度为50-200 ng/μL；所述引物工作浓度为10 ng/μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述引物选自NX-Tri1F与NX-Tri1R1组合、或者NX-Tri1F与NX-Tri1R2组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：若引物为NX-Tri1F与NX-Tri1R1组合，扩增基因片段长度为550 bp，PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，60 ℃复性20s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；

若引物为NX-Tri1F与NX-Tri1R2组合，扩增基因片段长度为1010 bp，PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，60 ℃复性20 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述酶切时，使用限制性内切酶BclI或NheI进行酶切，酶切体系中各成分的量或工作浓度为：步骤（2）所得纯化产物1 μg、限制性内切酶2 U、1×限制性内切酶Buffer、无菌水补齐体系至20 μL，限制性内切酶最优反应温度37 ℃下进行酶切反应，反应时间为1-1.5 h，酶切完成后，将酶切产物迅速置于冰上冷却。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述琼脂糖凝胶电泳中琼脂糖的浓度为1-2%。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述结果的判定方法为：有两个条带的禾谷镰刀菌为NX型禾谷镰刀菌，而只有一个条带的菌株为常规B型禾谷镰刀菌。