[发明专利]米尔伊丽莎白菌的检测引物组合物及检测方法

说明书

本发明属于病原微生物检测技术领域，公开了米尔伊丽莎白菌的检测引物组合物及检测方法，其中检测引物组合物包括三对引物EM02F/R、EM03cF/R和EM04cF/R中的至少一对，并基于该引物组合物构建了检测米尔伊丽莎白菌的方法。对于三对特异性引物，无论是单对引物扩增，还是随机两对引物组合及三对引物组合均可特异性的区分米尔伊丽莎白菌，且检测方法准确率高、费用低廉，为蛙类歪白病病原米尔伊丽莎白菌的快速检测、鉴定与预防控制奠定了基础。

技术领域

本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种米尔伊丽莎白菌的检测引物组合物及检测方法。

背景技术

米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)是伊丽莎白菌属的重要物种，最早分离于Mir空间站的冷凝水(Kim et al.2005)。这种条件致病菌对人类健康造成了重要危害，可以导致引起关节炎、尿路感染、肺炎和人类败血症。在两栖动物上也已有相关报道，感染米尔伊丽莎白菌的蛙会出现神经系统疾病，造成中枢神经系统损伤和类似于脑膜炎的症状(Huang et al.2019；Lei et al.2019；Trimpert et al.,2021)。米尔伊丽莎白菌感染的病蛙死亡率高，传播速度快，重复发病现象严重(Trimpert et al.2020)。

近年来，多种无尾目两栖动物包括黑斑蛙、尖刺蛙、林蛙、雨蛙等报道了米尔伊丽莎白菌感染的症状，病蛙通常会出现歪头和白内障等病症(Hu et al.,2017；Lei et al.,2019；Trimpert et al.2020)。对于牛蛙歪头、白内障病病原物的研究历史悠久。只是因为伊丽莎白菌属的病原菌分类地位及分类体系的混乱问题，导致很长时间以来没有明确牛蛙歪头、白内障病的致病病原的分类地位。如陈耀明(1994)报道了脑膜脓毒性黄杆菌会引起病蛙歪头和白内障病症。陈会波等(2000)发现牛蛙歪头白内障病原是黄杆菌。杨春浩分别于2009年发现嗜水气单胞菌，2010年发现藤黄葡萄球菌和浅黄假单胞菌都存在于患有歪头白内障病症的牛蛙组织。因此，建立准确高效的患歪头、白内障病牛蛙病原的快速检测方法对于牛蛙歪头、白内障病的治疗与防控至关重要。

Zhan等(2020)建立了米尔伊丽莎白菌的荧光定量PCR检测方法，可用于不同来源米尔伊丽莎白分离株的快速鉴定。胡瑞雪(2020)年用脉冲场电泳和Rep-PCR的方法研究了不同伊丽莎白分离株的分子流行病学。另外，全基因组测序的方法也已应用于米尔伊丽莎白菌的种属鉴定(秦振阳，2018)。这些鉴定伊丽莎白菌的方法虽高效且较准确，但需一定的仪器设备和较高的费用。目前国内外尚没有采用多重PCR方法进行牛蛙伊丽莎白菌进行分析鉴别的报道，故开发简单的快速鉴别牛蛙歪头白内障病原菌米尔伊丽莎白菌的多重PCR引物及应用于临床检测，对于牛蛙健康养殖和疾病控制具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供快速鉴别病原菌-米尔伊丽莎白菌的多重PCR引物及方法，实现该病原菌简单、低成本且准确、高效的确定。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明首先基于已分离获得的牛蛙米尔伊丽莎白菌菌株Mir-N11的全基因组序列分析，在其未知功能的基因编码区域，开发出了三对特异性PCR引物应用于米尔伊丽莎白菌的多重PCR扩增检测，其中三对特异性PCR引物的序列具体如下所示：

EM02F:5’-GCTTCCGCTTCTGATAATTGAC-3’，

EM02R:5’-GGAGACGAGCTATTAGTGTATCG-3’；

EM03cF:5’-AACTACTGTCACTAATC-3’，

EM03cR:5’-GAATTGTTAGCTGTTGAA-3’；

EM04cF:5’-CCAGTTTTTAGAGTTGAAAT-3’，