[发明专利]一种基于反向PCR技术验证基因敲除转化子的方法

说明书

本发明公开了一种基于反向PCR技术验证甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子的方法，通过在同源重组的抗性基因标签上设计反向PCR引物，并在反向PCR引物两侧选择合适的限制性内切酶位点，本发明通过将已有的反向PCR技术成功应用于利用基因同源重组原理获得甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子的验证中。相比于通过Southern blot方法验证甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子，反向PCR在实施过程中有着众多优势：成本低、高通量、高效率、准确性高等。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种基于反向PCR技术验证经同源重组原理获得的基因敲除转化子的方法，更具体地，涉及一种基于反向PCR技术验证经同源重组原理获得的甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子的方法，尤其是涉及甘蔗鞭黑粉菌SsHos2基因同源重组敲除转化子验证。

背景技术

甘蔗是重要的经济作物，中国甘蔗的种植面积在世界范围内排第三位，国内甘蔗种植面积占总糖料种植面积的86％。每年因为真菌病害的发生，造成甘蔗产量巨大的经济损失。甘蔗真菌性病害中以甘蔗鞭黑粉病最为严重。经鉴定其病原菌是担子菌门甘蔗鞭黑粉菌。甘蔗鞭黑粉菌担孢子通过有性配合形成双核菌丝后具有侵染甘蔗的能力。然而田间想要获得更好的防治效果，就需要充分了解影响其致病性的分子机理。在植物病理学研究中，反向遗传学是研究真菌致病性的重要手段之一。在甘蔗鞭黑粉菌致病性机理研究中，通过基因敲除了解目的基因在甘蔗鞭黑粉菌中的功能也是了解甘蔗鞭黑粉菌致病机理最直接有效的方法。

基因敲除主要涉及基因鉴定、基因敲除、转化子验证、表型分析。由于基因敲除效率尤其是在甘蔗鞭黑粉菌研究中基因敲除效率不高，因此往往需要通过大量筛选基因突变转化子来获得成功的基因缺失突变体。在转化子验证中，现有技术中通常是以Southernblot作为转化子验证的主要手段，例如中国专利CN103525854A公开了采用Southern blot对高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株进行验证，Southern blot主要实验步骤为：1)DNA提取2)DNA消解3)探针标记4)分子杂交5)免疫显色。由于Southern blot实验过程中需要的试剂成本较高且实验过程持续约一周时间，这严重影响了后续实验的进程。因此在甘蔗鞭黑粉菌的基因敲除研究中亟需提供一种成本低、高通量、高效率、准确性高的基因敲除转化子验证方法。

发明内容

本发明的目的在于克服甘蔗鞭黑粉菌研究中现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于反向PCR技术验证基因敲除转化子的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种基于反向PCR技术验证同源重组基因敲除转化子的方法，包括如下步骤：

S1.通过目的基因检测引物检测经基因同源重组原理获得的基因敲除转化子是否含有目的基因，进行初步验证；

S2.随机挑选不含目的基因的转化子进行摇菌培养，离心收集菌体，提取基因组DNA，通过后续反向PCR验证其正确性；

S3.在同源重组的抗性基因标签上设计反向PCR扩增引物，再在反向PCR扩增引物设计位点外侧的序列上选取相同的限制性内切酶位点，要求一侧的限制性内切酶位点位于其中一个同源臂附近的基因组上，另一侧的限制性内切酶位点位于抗性基因标签上，且在反向PCR扩增引物设计位点内侧的序列上不存在该相同的限制性内切酶位点；

S4.采用步骤S3选取的限制性内切酶位点对应的限制性内切酶对步骤S2的基因组DNA进行消解，消解后再对限制性内对切酶失活处理，接着用DNA连接酶连接成环状DNA分子；

S5.以步骤S4连接后的环状DNA分子为模板，采用步骤S3设计的反向PCR扩增引物进行PCR扩增反应，再将PCR产物电泳检测，若扩增条带与预设大小一致，则判定敲除成功，反之，则判定敲除不成功。