[发明专利]一种基于反向PCR技术验证基因敲除转化子的方法在审

专利信息
申请号: 202211008909.2 申请日: 2022-08-22
公开(公告)号: CN115341018A 公开(公告)日: 2022-11-15
发明(设计)人: 崔国兵;邓懿祯;袁梅婷;尹凯 申请(专利权)人: 华南农业大学
主分类号: C12Q1/686 分类号: C12Q1/686
代理公司: 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人: 赵崇杨
地址: 510642 广*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 反向 pcr 技术 验证 基因 转化 方法
【权利要求书】:

1.一种基于反向PCR技术验证同源重组基因敲除转化子的方法,其特征在于,包括如下步骤:

S1.通过目的基因检测引物检测经基因同源重组原理获得的基因敲除转化子是否含有目的基因;

S2.随机挑选不含目的基因的转化子进行摇菌培养,离心收集菌体,提取基因组DNA;

S3.在同源重组的抗性基因标签上设计反向PCR扩增引物,再在反向PCR扩增引物设计位点外侧的序列上选取相同的限制性内切酶位点,要求一侧的限制性内切酶位点位于其中一个同源臂附近的基因组上,另一侧的限制性内切酶位点位于抗性基因标签上,且在反向PCR扩增引物设计位点内侧的序列上不存在该相同的限制性内切酶位点;

S4.采用步骤S3选取的限制性内切酶对步骤S2的基因组DNA进行消解,消解后对限制性内切酶失活处理,再用DNA连接酶连接成环状DNA分子;

S5.以步骤S4连接后的环状DNA分子为模板,采用步骤S3设计的反向PCR扩增引物进行PCR扩增反应,将PCR产物电泳检测,若扩增条带与预设大小一致,则判定敲除成功,反之,则判定敲除不成功。

2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S4 DNA消解为将基因组DNA在含限制性内切酶的消解体系中36℃~38℃孵育3~5小时。

3.根据权利要求2所述方法,其特征在于,步骤S4 DNA消解为将基因组DNA在含限制性内切酶的消解体系中37℃孵育3~5小时。

4.根据权利要求2或3所述方法,其特征在于,所述消解体系为基因组DNA1μg,限制性内切酶1μL,cutsmart buffer 3μL,ddH2O补至30μL。

5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S4对限制性内切酶失活处理采用热失活的方式。

6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤S4所述DNA连接酶为T4-DNA连接酶。

7.根据权利要求6所述方法,其特征在于,DNA连接酶连接体系为T4 DNA连接酶1μL,T4-DNA连接酶缓冲液2μL,DNA消解产物10μL,ddH2O补至20μL。

8.根据权利要求6所述方法,其特征在于,DNA连接酶连接条件为15~17℃孵育6~12h。

9.根据权利要求1所述方法,其特征在于,要求选择的限制性内切酶位点使酶切、连接环状后的DNA分子不超过4kb。

10.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述基因敲除转化子为甘蔗鞭黑粉菌基因敲除转化子。

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