[发明专利]基于纳米孔测序仪的靶向扩增引物、扩增建库方法及应用

说明书

本发明提供一种基于纳米孔测序仪的靶向扩增引物、扩增建库方法及应用，设计特殊的靶向扩增引物，该靶向扩增引物由依次排序的定位序列、分子标签序列和扩增引物组成，将基于纳米孔测序平台靶向扩增高通量测序整个过程仅分为靶向扩增+混样末端修复+加接头测序三个步骤，在提高接头连接效率的同时直接引入高通量测序分子标签，避免待测序列的分子标签污染，且简化实验复杂程度，可被应用所有基于Nanopore测序仪的靶向扩增测序，包括但不限于对细菌和古菌、病毒的纳米孔测序。

技术领域

本发明涉及长读长测序领域，特别涉及一种基于纳米孔测序仪的靶向扩增 引物、扩增建库方法及应用。

背景技术

纳米孔测序技术依赖于一个纳米级的蛋白质孔，纳米孔作为一个生物传感 器被嵌入在一个由一组连接到传感器芯片上的微支架支撑的耐电聚合物膜中， 易位过程中离子电流的变化与传感区域中存在的核苷酸序列相对应，从而能够 对其进行解码，允许对单个分子进行实时测序。纳米孔测序技术正在被大量应 用于基因组组装、全长转录本测序和核苷酸突变检测，以及快速临床诊断和疫 情监测等领域。

现有纳米孔测序接头连接方式分为快速法测序接头连接和连接法测序接头 连接，快速法接头连接基于转座酶将待测DNA分子或RNA分子与纳米孔测序专 用接头连接上，然后加载到测序芯片中进行纳米孔测序。连接法接头连接基于 T4连接酶将待测DNA分子或DNA-RNA杂交分子与纳米孔测序专用接头连接上 (或将待测DNA分子或DNA-RNA杂交分子先与分子标签连接，再与纳米孔测序 专用接头连接上实现多样本测序)，形成待测双链核酸分子----分子标签---- 测序接头复合体，最后加载到测序芯片中进行纳米孔测序。然而快速法的接头 连接方式接头效率低下，在处理高通量样本测序时很难获得足够深度的测序数 据；连接法测序接头连接方式进行T/A接头连接，接头连接效率更高，且在处 理多样本高通量建库时需要引入分子标签，导致建库时需要更多的试剂成本和 时间成本。

目前引入分子标签的方式有以下几种：

1.如图1所示，在对低浓度核酸样本靶向扩增产物时，第一轮进行靶向扩 增并纯化去除引物干扰，第二轮扩增时将分子标签与第一轮扩增含有引 物序列退火相结合形成引物池二次扩增，接着将样本pooling并末端修 复，最后与连接法测序接头进行连接测序。

2.在对高浓度核酸样本靶向扩增产物时，如图2所示，将待测序核酸进行 末端修复纯化，然后与分子标签接头通过T/A连接，再以分子标签为引 物进行扩增并纯化，接着将样本pooling并末端修复，最后与连接法测 序接头进行连接测序。

3.在对高浓度核酸样本靶向扩增产物时，如图2所示，将待测序核酸进行 末端修复纯化，然后与分子标签的接头通过T/A连接，接着将样本 pooling并与多样本测序接头进行连接测序。

然而以上提到的接头连接方式均存在效率低下、分子标签引入容易造成污 染、建库时间长等问题，无法很好地满足快速高通量的测序需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的长片段靶向扩增引物、扩 增建库方法及应用，靶向扩增引物设计简单，扩增和建库过程简单易懂，且为 纳米孔测序仪提供了一整套简单经济的分子标签引物设计方法和后续调整的建 库方案，设计的分子标签能直接被测序仪识别，具有广泛的应用价值。

为实现以上目的，第一方面，本技术方案提供了一种基于纳米孔测序仪的 靶向扩增引物，由依次排序的定位序列、分子标签序列和扩增引物序列组成。

在一些实施例中，扩增引物为16s基因通用引物，覆盖16srDNA基因全长。

16s序列是所有细菌共有的基因，本方案针对细菌序列的16s基因在保守区 设计扩增引物，进而使得该靶向扩增引物可适用于各类的细菌。

在一些实施例中，分子标签序列选自96种通用的分子标签序列的一种或者 多种。