[发明专利]一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法

说明书

本发明提供了一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述微液滴平铺成单层；对所述微液滴进行LAMP反应，在LAMP反应过程中，实时监测微液滴荧光信号。基于微液滴的数字化检测方式可以有效提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和准确度，且在待检样品的病毒浓度很低的情况下依然能快速检测出新冠病毒。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法。

背景技术

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增。

LAMP操作简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应；并且，其结果的检测也很简单，通过肉眼观察白色浑浊或DNA染料荧光的生成来判断，简便快捷，非常适合快速诊断。

但是传统LAMP是定性或相对定量检测，且当样本中微生物含量过低时，LAMP检测会出现假阴性结果，LAMP的灵敏度和准确性还有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，本发明的方法能够实现绝对定量检测，且本发明的方法检测灵敏度和准确度高。

本发明提供了一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，包括以下步骤：

1)将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述LAMP反应溶液包括LAMP检测用试剂与待检样品；

2)将所述微液滴平铺成单层后，进行LAMP反应，实时监测微液滴荧光信号，统计有荧光的微液滴的比例；通过有荧光微液滴的比例，定量推算出目标微生物核酸分子的拷贝数。

优选的，所述LAMP检测用试剂包括针对新型冠状病毒核酸基因组的保守片段的引物。

优选的，所述新型冠状病毒核酸基因组的保守片段包括新型冠状病毒E基因。

优选的，所述LAMP检测用试剂包括用于扩增新型冠状病毒E基因的引物组；所述引物组包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB；所述F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述LAMP检测用试剂还包括DNA染料、脱氧尿苷5'-三磷酸、尿嘧啶-DNA糖基化酶、磷盐酸盐和蛋白变性剂。

优选的，所述油相为HFE 7500或FC40。

优选的，所述平铺为将所述微液滴平铺于可封闭的玻璃腔室中；所述微液滴的直径等于所述玻璃腔室的空腔高度；对所述微液滴进行LAMP反应包括对所述玻璃腔室加热至LAMP反应所需的温度后保温，触发LAMP反应。

优选的，所述微液滴的直径为100～2000μm。

优选的，所述实时监测微液滴荧光信号包括：采用imageJ对微液滴进行实时追踪，量化微液滴中的荧光信号随时间的变化。