[发明专利]用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、试剂盒和应用

说明书

本发明涉及一种基于TaqMan探针法的用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒以及它们用于检测E.Coli DNA残留的应用。本发明具有操作简单、定量精准、特异性强、检测周期短、检测成本低等优点，特别适合用于E.Coli DNA残留检测，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物分析检测领域，更具体地涉及基于TaqMan探针法的用于检测E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒以及它们的应用。

背景技术

基因治疗是指将有正常功能的基因或其他基因通过基因转移方式(例如通过质粒载体)导入到患者体内，并使之表达功能正常的基因，或表达患者原来不存在或表达很低的外源基因，从而达到治疗目的。与常规治疗手段相比，基因治疗能从DNA源头上解决疾病的发生，从而实现单次治疗带来长期疗效。

腺相关病毒(AAV)载体治疗更是其中最重要的治疗技术之一。作为目前最有前途的基因治疗载体，AAV载体具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，因而在临床试验中得到广泛应用。AAV的生产平台主要有三种：三质粒转染体系、杆状病毒表达载体体系和包装细胞体系。目前，“三质粒转染”技术仍然占据AAV基因治疗的主流地位。

然而，在细菌扩增培养到质粒DNA纯化的整个过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组DNA非常容易断裂，导致最终的质粒纯化产物中往往会存在一定量的宿主基因组DNA，而宿主基因组DNA片段不利于真核细胞的基因转染。因此，基因治疗对重组质粒DNA的质量要求十分严苛，质粒的质量会严重影响转染效率和AAV的产量和质量。根据WHO的相关规定，符合体内使用质量标准的质粒制品中的宿主基因组DNA含量必须控制在可接受的较低水平。

实时荧光定量PCR(qPCR)是一种实时荧光测定PCR循环后产物总量的方法，常用于对质粒中E.Coli DNA残留量进行检测。qPCR可在宽浓度范围内以高精度对样品的初始模板拷贝数或浓度进行定量。qPCR具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于生命科学研究的各个领域，例如基因的差异表达分析、SNP检测、等位基因的检测、药物开发、临床诊断、转基因研究等。

常用的qPCR方法包括染料法和TaqMan探针法。相比于染料法，基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR技术具有操作简便、特异性高且重复性好的优点。TaqMan探针法荧光定量PCR适用于病原体检测、宿主核酸残留检测、疾病耐药基因研究、药物疗效考核、遗传疾病的诊断等。新型TaqMan-MGB探针还可用于分析基因突变，有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

基于此，本发明人基于TaqMan探针法对质粒中E.Coli DNA残留检测进行了研究。

发明内容

本发明的目的是提供基于TaqMan探针法的用于检测质粒中E.Coli DNA残留的引物探针组合、包含其的试剂盒和它们的相关应用，以及使用它们的检测方法。

在一方面，本发明提供了用于检测E.Coli DNA残留的如下5组引物探针组合：

第1组：SEQ ID NO：1所示的正向引物、SEQ ID NO：2所示的反向引物和SEQ ID NO：3所示的探针；

第2组：SEQ ID NO：4所示的正向引物、SEQ ID NO：5所示的反向引物和SEQ ID NO：6所示的探针；

第3组：SEQ ID NO：7所示的正向引物、SEQ ID NO：8所示的反向引物和SEQ ID NO：9所示的探针；

第4组：SEQ ID NO：10所示的正向引物、SEQ ID NO：11所示的反向引物和SEQ IDNO：12所示的探针；以及