[发明专利]检测和鉴别哈维氏弧菌的引物及其应用

说明书

本发明属于病害微生物检测技术领域，具体涉及检测和鉴别哈维氏弧菌的引物及其应用。本发明根据维氏弧菌毒力基因的保守区设计了用于检测和鉴别维氏弧菌的检测引物对及试剂盒，结果表明，利用本发明所述的引物对或含有所述引物对的试剂盒对维氏弧菌进行鉴定时特异性强、灵敏度高，并在复杂水体维氏弧菌的检测中具有一定的使用价值。

技术领域

本发明属于病害微生物检测技术领域，具体涉及检测和鉴别哈维氏弧菌的引物及其应用。

背景技术

弧菌(Vibrio)是水生环境的“常住居民”，可与真核生物共生或致病，引起弧菌感染，导致霍乱、弧菌病、肠胃炎、败血症等致命的食源性疾病，严重影响水产养殖业发展和水产品安全。近年来，哈维氏弧菌已成为海水养殖中危害最大的细菌性病原之一，具有耐药性强、毒性大、可侵染多种宿主的特点。且暂时没有有效的安全防控手段，不仅给水产品安全带来巨大威胁，同时每年对海水养殖业造成了巨大经济损失。

弧菌病一旦暴发便很难控制，因此，在水产养殖产业中，我们采用预防为主的防治措施，需要对养殖水体进行长期的实时监测。然而目前的检测方法特异性并不高，很容易造成假阳性。因此，急需要提高哈维氏弧菌检测技术的特异性和灵敏性，这对于监测哈维氏弧菌病原的分布，预警病害的发生和流行，有效防控该病害至关重要。

luxR、toxRvh、chiA、serine protease和vhh被证实是哈维氏弧菌的关键毒力基因。目前少有针对毒力基因对哈维氏弧菌进行检测和鉴别的手段，因此，针对以特征性毒力基因为靶标，设计用于鉴别哈维氏弧菌的检测手段或检测体系，是本发明研究开发的重点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测和鉴别哈维氏弧菌的引物及其应用。

本发明提供了鉴定哈维氏弧菌的引物对，其包括chiA-F和chiA-R。

进一步的，所述的chiA-F的核酸如SEQ ID NO:1所示；所述的chiA-R核酸如SEQ IDNO:2所示。

更进一步的，所述的引物对是根据哈维氏弧菌毒力基因chiA的1306～1424保守区域设计，全长129bp，用于哈维氏弧菌鉴定时特异性强、灵敏度高。

本发明提供了试剂盒，其包括本发明所述的引物对和扩增试剂。

进一步的，所述的扩增试剂包括MgCl₂、KCl、dNTP和AceTaq DNA Polymerase和ddH₂O。

更进一步的，所述的试剂盒中各成分的使用浓度分别包括：DNA模板2.0～4.0μL，chiA-F 10pmol/L，chiA-R 10pmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，KCl50mmol/L，dNTP 250μmol/L，AceTaq DNA Polymerase 0.2U/mL。

本发明提供了所述的引物对，和/或所述的试剂盒及在检测和鉴别哈维氏弧菌中的应用。

本发明提供了检测和鉴别哈维氏弧菌的方法，其包括诊断目的和非诊断目的的检测和鉴别哈维氏弧菌的方法，本发明对此不做限定。所述非诊断目的的检测方法，包括对环境样本、食物或饮用水中是否含有哈维氏弧菌进行检测。

进一步的，本发明提供了非诊断目的的检测和鉴别哈维氏弧菌的方法，其包括以下步骤：

(1)以DNA样品作为扩增模板，使用本发明所述的引物对或本发明所述的试剂盒进行PCR扩增；

(2)检测扩增产物，若扩增出129bp的DNA片段，则样品含有哈维氏弧菌；否则，样品中不含哈维氏弧菌。