[发明专利]过表达基因galK、galT及其工程菌

说明书

本发明针对野生型菌株WK对半乳糖利用的局限性，发现了野生型菌株WK中调控半乳糖代谢的两个关键基因半乳糖激酶基因galK和UDP‑葡萄糖‑己糖‑1‑磷酸尿苷酰转移酶基因galT，并利用这两个关键基因对野生型菌株WK进行改造，得到工程菌WK‑Gal‑2、WK‑Gal‑3和WK‑Gal‑4。大幅提高对海藻生物质的利用效率。工程菌对半乳糖的利用效率与丁醇产量都有不同程度的提升，其中菌株WK‑Gal‑4的提升效果是最优的。因此，本发明不仅在一定程度上提升了产溶剂梭菌对海藻生物质中半乳糖的利用效率，也促进其转化生物丁醇的过程，为拓展产溶剂梭菌WK的底物范围提供了新方法。

技术领域

本发明涉及过表达基因galK和galT，及基于此构建工程菌WK-Gal-2、WK-Gal-3及WK-Gal-4在提升利用半乳糖转化生物丁醇效率的应用。

背景技术

在能源的可持续发展进程中，可再生的新能源逐渐替代化石类能源将是历史发展的必然。作为发展潜力巨大的生物燃料成员之一，生物丁醇以其较高的热能值、低挥发度、低腐蚀性等优势，被认为是继生物乙醇之后替代化石燃料的另一最佳选择。传统的生物丁醇生产方式是以产溶剂梭菌为出发菌株，通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)代谢途径经过厌氧发酵进行。然而，这个生产过程始终面临着原料成本高、丁醇产率低且副产物占比高等问题，这些均严重阻碍了生物丁醇的工业化生产进程。因此，现阶段比较迫切的任务是建立和完善一种经济且高效的产醇发酵体系，在提高丁醇产量并降低生产成本的同时，也为后续生物丁醇的真正落地与工业化提供理论与实践基础。

海藻生物质作为第三代生物质能源的重要组成之一，具有碳水化合物含量高、储量丰富、价格低廉等优势，特别是富含半乳糖、葡萄糖以及鼠李糖等可发酵糖的红藻是目前研究最为广泛的海洋生物质之一。但从菌株利用海藻生物质的效率来看，由于海藻生物质成分的多样性也给菌株利用带来了挑战，往往微生物偏好的碳源类型在海藻水解产物中可能占比不高，且葡萄糖阻遏效应的存在也可能干扰了菌株对其他单糖的利用效率造成底物浪费，而解决这一问题的有效途径之一则可以通过提升菌株对生物质中其他可发酵糖的利用。例如，Guamán等在“xylA和xylB的过表达是提蔗糖伯克霍尔德氏菌的木糖利用率和聚-3-羟基丁酸生产的成功策略”(Journal of Industrial MicrobiologyBiotechnology，2018，45(3)，165-173)一文中表明，通过在模式菌株Burkholderia sacchari中过表达编码木糖异构酶和木糖激酶的基因(xylA/xylB)，工程菌株的木糖消耗量提高了34％，聚-3-羟基丁酸酯的产量提高了25％，这项研究说明过表达木糖利用的相关基因是促进木糖利用及聚-3-羟基丁酸酯生产的有效策略。因此，采取相似策略，通过提升梭菌对海藻生物质中的其他可发酵糖类的利用效率，可以为后续整体促进梭菌菌株利用海藻生物质高产生物丁醇提供指导意义。

对于现有野生型菌株Clostridium sp.WK来说，其在发酵过程中以半乳糖为底物时丁醇产率较高，具有高产生物丁醇的潜力，但在糖利用方面存在明显的葡萄糖效应，菌株对半乳糖利用并不完全，这将限制其后续对红藻水解液(半乳糖含量达80％以上)的利用，造成成本增加、资源浪费等问题，不利于工业化生产。和其他微生物一样，产溶剂梭菌在发酵过程中都是将底物先转化成丙酮酸再进行ABE发酵，因此对底物的代谢过程进一步分析，通过获得该过程的关键限速酶信息，可为提升丁醇产量提供帮助。基于此，通过现有分析手段如RT-qPCR、同位素标记、转录组及蛋白组分析等，获取半乳糖利用的关键基因，在探究其利用机制的同时，运用过表达等基因工程技术，对野生型菌株进行改造，提升其底物的利用效率，促进生物丁醇等高附加值产品合成的同时进一步降低生产成本。

发明内容

本发明针对野生型菌株WK对半乳糖利用的局限性，发现了野生型菌株WK中调控半乳糖代谢的两个关键基因，并利用这两个关键基因对野生型菌株WK进行改造，得到的工程菌大幅提高对海藻生物质的利用效率。

本发明公开了一种半乳糖激酶基因galK，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示。