[发明专利]缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L-氨基酸中的应用

说明书

本发明公开了缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L‑氨基酸中的应用。本发明提供了一种来源于热泉宏基因组的缬氨酸脱氢酶，并通过定点突变对该缬氨酸脱氢酶进行改造，获得了缬氨酸脱氢酶突变体，显著提高了该酶对多个大位阻底物的催化活力。本发明所述缬氨酸脱氢酶和缬氨酸脱氢酶突变体表现出良好的温度稳定性，可用于L‑2‑氨基丁酸、L‑叔亮氨酸和L‑苯甘氨酸等高值非天然手性氨基酸的生物催化合成，底物转化率99％，所得产物的ee值99％，时空产率最高可达251.49g·Lsupgt;‑1/supgt;·dsupgt;‑1/supgt;，具有较高的实际应用价值。本发明丰富了手性氨基酸制备用酶工具库，为高值非天然手性氨基酸的生物催化合成提供了新的、高效酶催化剂。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域。更具体地，涉及缬氨酸脱氢酶及其突变体在制备手性L-氨基酸中的应用。

背景技术

氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.X)是一类以NAD(H)或NADP(H)为辅酶，可逆的催化α-酮酸还原胺化生成对应氨基酸的氧化还原酶。氨基酸脱氢酶催化酮酸的还原胺化反应，以NH₃作为氨基供体，热力学上反应平衡倾向于氨基酸生成的方向，从原子经济性的角度来看具有极大优越性，在非天然手性氨基酸的胞外酶催化制备或胞内生物合成领域受到广泛关注。同时，氨基酸脱氢酶也可通过分子改造技术转变为胺脱氢酶，应用于手性胺或手性胺醇等高值手性化合物的合成(陈飞飞,汪东浩,许建和,等.胺脱氢酶催化合成手性胺的机遇与挑战[J].生物加工过程,2020,18(1):10.)。

缬氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.8)是氨基酸脱氢酶家族的一员，以缬氨酸或对应酮酸作为其天然底物。相较于与研究较多且同为Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶亚家族的亮氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶，已报道的缬氨酸脱氢酶非常少，极大限制了缬氨酸脱氢酶的实际应用。缬氨酸脱氢酶表现出独特的底物偏好性，是开发新型手性氨基酸与手性胺合成用酶催化剂的重要素材，新型缬氨酸脱氢酶的挖掘与改造具有重要的科学研究价值与实际应用前景。

热泉作为一种极端的生态环境，孕育了许多独特的生命形式，是发现新型酶催化剂的重要资源。但是，热泉中的多数微生物都是不能被培养或难培养的，采用传统的基于微生物培养的酶催化剂挖掘手段会导致大部分潜在新颖酶催化剂被遗漏。采用宏基因组酶挖掘技术对热泉宏基因组进行挖掘，有望获得新的缬氨酸脱氢酶，为高值非天然手性氨基酸的生物催化合成提供新的、高效酶催化剂。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种缬氨酸脱氢酶

本发明的第二个目的是提供一种缬氨酸脱氢酶突变体。

本发明的第三个目的是提供所述缬氨酸脱氢酶或所述缬氨酸脱氢酶突变体在制备手性L-氨基酸中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种制备手性L-氨基酸的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过对云南热泉(pH 3，75.3℃)沉积物的宏基因组测序数据进行基因功能预测，并以现有的缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列(NCBI ID：Q53872.1)作为探针，从热泉宏基因组中获得了一个与探针氨基酸序列一致性为46％的新的缬氨酸脱氢酶，命名为HsVDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码HsVDH的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

基于所获得的缬氨酸脱氢酶HsVDH，本发明通过定向点突变还获得了其突变体，所述突变体是由SEQ ID NO.3所示缬氨酸脱氢酶氨基酸序列的第294位异亮氨酸定点突变为缬氨酸或丙氨酸得到，利用该缬氨酸脱氢酶或其突变体可制备得到手性L-氨基酸，对高值非天然手性氨基酸的生物催化合成具有重要意义。

本发明提供了一种缬氨酸脱氢酶，所述缬氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明还提供了一种编码上述缬氨酸脱氢酶的基因。