[发明专利]一种用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。通过比对斯克里布纳短体线虫的18S、28S和ITS等多个区域、不同短体线虫的基因组序列，设计筛选出一套特异性高、灵敏性强的用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物对。利用该特异性引物对和RPA试剂盒，以斯克里布纳短体线虫为模板进行反应，所获的特异性片段大小为329bp；以其他不同种线虫为模板时，均无条带。该特异性引物可检测出单条或混合样本中的斯克里布纳短体线虫，特异性高，灵敏性强，操作便利，对仪器设备的依赖性低，可以应用于田间病害发生时早期诊断、辅助鉴定为病害防治提供指导。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

短体线虫(Pratylenchus spp.)又称根腐线虫，主要通过在寄主植物根系穿刺、取食和繁殖，引起根部坏死腐烂，进而导致植物根部系统功能丧失。短体线虫是一种迁徙性内寄生线虫，其幼虫和成虫均为线性，除卵和一龄幼虫以外，其他虫态均可侵染寄主植物。由短体线虫侵染引起的损伤，会为其他真菌、细菌等病原物的的入侵提供便利，造成植物复合侵染现象，引起更大的经济损失。据统计，全球已报道的短体线虫有效种超过100个，斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)是对农业生产危害较大种类之一。斯克里布纳短体线虫在我国普遍发生，寄主广泛，严重危害小麦、玉米、大豆、高粱、番茄等多种作物。因此，建立一种快速检测斯克里布纳短体线虫的方法可以对于线虫的病原鉴定、田间防治及口岸检验检疫等提供一定的技术支持。

短体属线虫的种类鉴定主要包括传统的形态学鉴定、基于DNA分子的检测技术等。传统的形态学鉴定主要以线虫外部和内部形态特征作为分类依据，

形态学鉴定只适用于成虫，短体线虫属种类多，许多种类形态特征较为相似，种间鉴别诊断特征少，且种间存在变异现象，难以区分，而且形态学鉴定具有耗时长、需要较强的专业技能等缺陷，造成短体属的形态鉴别方面存在一定困难和制约。随着生物化学技术的发展，分子生物学也被广泛应用于短体线虫的鉴定中。利用同工酶对短体属进行物种诊断，该方法是采用EST(酯酶)、MDH(苹果酸脱氢酶)、PMG(磷酸葡萄糖变位酶)等不同的同工酶图表型来进行判断。该方法可以比较准确的对线虫的种类进行分别，但该技术需要大量线虫，操作复杂，且蛋白的表达可能会受到环境限制具有一定的不确定性。因此，利用生物化学技术对短体线虫进行鉴别无法得到普遍应用。随着学科的发展和技术的进步，为分子鉴定的发展提供了有利的发展环境，提高了线虫种类鉴定的准确性和高效性。目前所应用于短体线虫鉴别的分子鉴定方法为利用PCR技术对提取到单条线虫的DNA利用通用引物对rDNA-ITS、rDNA 28s D2～D3区和mtDNA-COI区等进行目的片段扩增、克隆测序分析等步骤。该技术可准确判断出线虫的种类，但耗时较长且对操作人员的专业技术有所要求。因此，继续开发准确、高效、对仪器设备和人员要求低的的斯克里布纳短体线虫检测技术具有重要的实践价值。

因此，如何优化用于检测斯克里布纳短体线虫的的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法。恒温扩增技术与常规PCR技术相比，具有灵敏性、特异性强，操作便捷，耗时短，不需要昂贵精密仪器等优势。利用重组酶、单链结合蛋白和聚合酶进行扩增反应，只需要一对30bp-35bp的引物和待测DNA模板参与反应；可在37℃～45℃任一恒定温度进行，反应15min～30min即可；灵敏度高，特异性强，操作简单不依赖于复杂精密的仪器，可广泛推广应用与田间等地。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于检测斯克里布纳短体线虫的RPA引物，RPA引物的核苷酸序列如下：

Ps-RPAF1：5′-TGACAAGTGAAAAATTCTAGTCTTATCG-3′，SEQ ID NO.1；