[发明专利]一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组及分枝杆菌和真菌感染的测序方法

说明书

本发明公开一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，包括特异性基因IS6100、hsp65、rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、URA5、CAP10、mtLSU、Kex‑1或MP1引物组。本发明利用多重PCR技术将待测病原菌靶基因在一个反应中进行扩增，结合纳米孔测序平台对特异性基因扩增子进行高通量检测，可同时检测出6种分枝杆菌和12种真菌。

技术领域

本发明涉及纳米孔测序技术技术领域，尤其是涉及一种分枝杆菌和真菌基因特异性引 物组及分枝杆菌和真菌感染的测序方法。

背景技术

结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和侵袭性真菌感染的肺病患者在临床表现上具有较高 相似性，表现为咳嗽、咳痰、发烧。影像学上也都可以表现为肺部阴影或肺空洞，给临床的 诊断和治疗带来一定的困难。传统的微生物检测金标准为病原菌培养，但是分枝杆菌和真菌 的培养时间较长、培养基较为苛刻，难以做到实施诊断，有可能耽误治疗效果。近年来分子 诸多诊断技术，例如实时荧光定量PCR技术和宏基因组测序技术 (Metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS)也开始广泛运用于临床诊断。但是对于肺 病患者来说，实时荧光定量PCR虽然可以诊断结核分枝杆菌，但是对于非结核分枝杆菌和真 菌诊断缺乏有效的诊断措施；宏基因组测序技术虽然也能够全面的区分结核分枝杆菌、非结 核分枝杆菌和真菌感染，但是涉及到检测费用昂贵，且对于低丰度的病原菌检测具有一定的 受限性。目前，临床缺乏一种经济、高效、快速、准确的手段来区分结核分枝杆菌、非结核 分枝杆菌和真菌感染。目前临床上还没有对于肺部阴影是由结核、非结核、侵袭性真菌引起 的致病菌进行有效区分，而这个菌种的检测和区分涉及到治疗方式不同。

纳米孔测序技术是最近几年兴起的新一代测序技术，是一种集合通量高、速度快、超 长读长和成本低于一体的第三代测序技术(又称第四代测序技术)，基于这些优势，纳米孔测 序技术在病原体微生物快速诊断上拥有巨大的前景。目前的纳米孔测序技术无法检测结核分 枝杆菌、非结核分枝杆菌和侵袭性真菌。

发明内容

本发明为了克服现有技术纳米孔测序技术无法检测结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和 侵袭性真菌，提供一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组及应用引物组的测序方法，具有简 便、快速、全面、准确等优点，有利于指导临床对于结核病、非结核病以及侵袭性真菌感染 的区分等优点。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种分枝杆菌和真菌基因特异性引物组，包括特异性基因IS6100、hsp65、rpoB、gyrA、L1A1、RPB1、Tub2、CaM、URA5、CAP10、mtLSU、Kex-1或MP1引物组，其中，IS6100的引物序列包含具有SEQ01所示的核苷酸序列和包含具有SEQ02所示的核苷酸序列；或者hsp65 的引物组包含具有SEQ03所示的核苷酸序列和包含具有SEQ04所示的核苷酸序列；或者rpoB的引物组包含具有SEQ05所示的核苷酸序列和包含具有SEQ06所示的核苷酸序列；或者gyrA的引物组包含具有SEQ07所示的核苷酸序列和包含具有SEQ08所示的核苷酸序列；或者L1A1的引物组包含具有SEQ09所示的核苷酸序列和包含具有SEQ10所示的核苷酸序列；或者RPB1的引物组包含具有SEQ11所示的核苷酸序列和包含具有SEQ12所示的核苷酸序列；或者Tub2的引物组包含具有SEQ13所示的核苷酸序列和包含具有SEQ14所示的核苷酸序列；或者CaM的引物组包含具有SEQ15所示的核苷酸序列和包含具有SEQ16所示的核苷酸序列；或者URA5的引物组包含具有SEQ17所示的核苷酸序列和包含具有SEQ18所示的核苷酸序列；或者CAP10的引物组包含具有SEQ19所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的核苷 酸序列；或者mtLSU的引物组包含具有SEQ21所示的核苷酸序列和包含具有SEQ20所示的 核苷酸序列；或者Kex-1的引物组包含具有SEQ23所示的核苷酸序列和包含具有SEQ24所 示的核苷酸序列；或者MP1引物组包含具有SEQ25所示的核苷酸序列和包含具有SEQ26所 示的核苷酸序列。