[发明专利]恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株及其应用

说明书

本发明公开了恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株及其应用。该突变株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ΔPP3142，是将恶臭假单胞菌KT2440的糖转移酶基因PP_3142的第72bp到第1190bp区域进行无痕敲除后获得的，所述的PP_3142基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本发明所述的突变株ΔPP3142在液面形成生物膜形成能力显著削弱，但在固体表面的粘附与生物膜形成能力与野生型菌株KT2440无明显差异，可应用于水体环境治理和修复等场景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种液面生物膜缺陷型恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株及其应用。

背景技术

恶臭假单胞菌是一种广泛存在于水体和土壤环境中的革兰氏阴性菌，具有较强的环境适应能力，并且能够分解多种芳香族化合物和吸附多种重金属，可用于开发多种微生物技术，包括环境污染物的治理、促进作物生长的菌剂和微生物杀虫剂等，在环境治理和农业生产中的具有较大应用价值。恶臭假单胞菌具有较强的聚集能力，能够在多种环境中形成的生物膜。生物膜是细菌的一种群体结构，主要由菌体和细菌分泌的胞外基质组成，其内部具有一定的三维结构，能够帮助胞外酶更好地分解营养物质，同时也能够帮助细菌群体抵抗外界胁迫因素，提高种群的环境适应能力。有研究表明，细菌形成生物膜后，对多种外界胁迫因素的抵抗能力会显著提高，如宿主免疫系统、抗生素和氧化胁迫因素等。生物膜的形成可以使细菌群体稳定附着在特定介质上，利用生物膜的该特性可将具有特定功能的菌株搭载在人工载体上，投入水体环境中，实现水体治理和菌体回收等过程。

恶臭假单胞菌的胞外基质主要成分为胞外粘附蛋白和胞外多糖。目前在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440基因组中鉴定的粘附蛋白有两种，分别是LapA和LapF，LapA是生物膜形成的关键因素，直接影响菌体与介质表面和菌体与菌体间的粘附，敲除lapA后菌株无法形成生物膜，而LapF并非生物膜发育的必要基质成分，但会影响菌株在根际的定植。恶臭假单胞菌KT2440中的胞外多糖合成基因簇有4个，分别是PP_1277-1288(合成藻酸盐)、PP_2629-2638(合成细菌纤维素)、PP_1795-1788和PP_3132-3142，胞外多糖主要作用是提高生物膜的稳定性。PP_3142是PP_3132-3142基因簇的最后一个基因，预测的编码产物为糖转移酶，具体功能还未得到深入研究。

恶臭假单胞菌不仅能依附在固体介质表面上形成生物膜，而且还能在气液界面上形成稳定且厚实的生物膜，液面生物膜漂浮于水体表面，可造成干扰氧气进入水体和干扰表水层微生物生长等影响，给恶臭假单胞菌在水体环境中的应用带来一定的影响，因此，为提高恶臭假单胞菌的应用潜力，需要对其进行改造，获得既能在固体表面正常形成生物膜，又不会在液面形成稳定生物膜的菌株。目前已有多株恶臭假单胞菌完成了基因组测序，并且有完善的遗传操作体系，使得利用基因工程方法对菌株进行改造成为可能，通过敲除或敲入特定基因，改变菌株特性，使其具备更优良的特性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的状况提供一株恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株，该突变株在气液界面形成生物膜能力显著减弱，但在固体表面上能够正常形成生物膜，从而提高其在水体环境中的应用潜力，其可作为底盘微生物进行进一步的功能改造，应用于水体治理和修复等场景。

本发明的第一个目的是提供一种恶臭假单胞菌PP_3142基因敲除突变株，其是将恶臭假单胞菌的PP_3142基因第72bp到第1190bp区域进行无痕敲除后获得，所述的PP_3142基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440，其保藏编号为ATCC No.47054。

本发明的第二个目的是提供一种削弱恶臭假单胞菌液面生物膜形成能力的方法，包括以下步骤：将恶臭假单胞菌野生株中的糖转移酶基因PP_3142第72bp到第1190bp区域进行无痕敲除，所述的PP_3142基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。