[发明专利]一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法

说明书

本发明提供了一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，包括（1）分别建立稳定表达GFP绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞和mCherry红色荧光蛋白的内皮细胞；（2）将稳定表达GFP绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞系、稳定表达mCherry的内皮细胞以及DAPI染色的肿瘤相关成纤维细胞混合接种于小室中培养，获得宫颈癌混合结构细胞3D类器官。本发明采用SiHa、HeLa等宫颈癌上皮细胞与内皮细胞（HUVEC）及患者来源的肿瘤相关成纤维细胞（CAF）混合成球构建类器官，不仅弥补了单纯宫颈癌上皮细胞无法成球的缺陷，而且相比2D培养，基因表达与人体更为接近，且HUVEC及患者来源的CAF还原了宫颈癌肿瘤微环境，更为仿生。

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及一种生物细胞培养技术，具体来说是一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法。

背景技术

全球女性宫颈癌(cervicalcancer，CC)发病率、死亡率排名第四。据估计，每年新发宫颈癌病例约为604000例，而每年死亡人数约为342000人，是严重威胁女性健康的妇科三大恶性肿瘤之一。随着HPV疫苗及宫颈癌三阶梯筛查在全球范围逐渐被推广，宫颈癌死亡率有所下降。但在许多发展中国家，宫颈癌仍是女性死亡的重要病因。除了手术、放疗和化疗等传统治疗方式，宫颈癌新型靶向药物治疗相关的基础研究和临床试验正如火如荼地展开。因此，为进一步提高、改善宫颈癌靶向药物治疗效果，我们迫切需要更为深刻地认识宫颈癌的生物学特性以及纷繁复杂的肿瘤微环境，进一步理解宫颈癌的发生发展机制。

既往宫颈癌相关基础研究主要依赖于传统2D细胞系，例如人源永生化细胞系HeLa、SiHa以及鼠源细胞系TC1等等。借助这些2D细胞系或利用这些2D细胞系构建荷瘤小鼠模型，研究者们得以对宫颈癌的生物学特性有了初步认识，如侵袭、转移、耐药等等。尽管培养传统2D细胞系及构建相应的荷瘤小鼠模型的操作较为简便，培养成本低，但仍具有显著的局限性。传统细胞系一般通过平面培养皿培养后用于机制研究，而细胞培养皿只能提供平面培养条件，在细胞接触、粘附、乏氧、代谢等方面有别于体内三维环境，与体内的真实情况具有显著差异。然而我们的前期研究发现单纯宫颈癌细胞系难以构建3D结构。

结合目前研究报道肿瘤间质成分在肿瘤的发生进展中发挥着关键作用，可提供促癌微环境；其中成纤维细胞和血管内皮细胞是宫颈癌微环境中重要的结构细胞，前者是肿瘤间质的关键组成成分，而后者形成脉管内衬。由此，我们提出假设：传统宫颈癌上皮细胞系3D培养失败很可能与缺乏肿瘤间质中其他结构细胞提供的营养及结构支持有关，从而无法还原体内宫颈癌的三维生长模式以及复杂的肿瘤微环境。因此，若能利用3D细胞培养技术，构建含有3种结构细胞(上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞)的宫颈癌混合细胞3D类器官模型，将更贴近体内肿瘤微环境，也将为宫颈癌的分子机制研究和临床个性化用药提供新方向和新思路。

综上，为了更好地研究宫颈癌的发病机制、便于药物筛选以实现个体化精准治疗，研发一种仿生且易于构建的宫颈癌类器官，对于宫颈癌发病机制的深入研究及临床药物的筛选评估都具有重大意义与价值。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，所述的这种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法要解决现有技术中的宫颈癌体外研究不够仿生、无法模拟体内肿瘤微环境的问题。

本发明提供了一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别建立稳定表达GFP绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞和mCherry红色荧光蛋白的内皮细胞；

(2)将稳定表达GFP绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞系、稳定表达mCherry红色荧光蛋白的内皮细胞以及DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色的肿瘤相关成纤维细胞(CAF)混合接种于小室中培养，获得宫颈癌混合结构细胞3D类器官。