[发明专利]一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法

权利要求书

1.一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别建立稳定表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞和红色荧光蛋白的内皮细胞；

（2）将稳定表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞系、稳定表达红色荧光蛋白的内皮细胞以及DAPI染色的肿瘤相关成纤维细胞混合接种于小室中培养，获得宫颈癌混合结构细胞3D类器官。

2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，采用慢病毒转染的方法获得表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞和表达红色荧光蛋白的内皮细胞，使用嘌呤霉素对其进行筛选以获得稳转株；所述步骤（2）中，小室为可置于12孔板孔格中，含有261个用于构建细胞球小格的低粘附小室。

3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，稳定表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞系、稳定表达红色荧光蛋白的内皮细胞以及DAPI染色的肿瘤相关成纤维细胞的混合比例以细胞数计算，为9:1:3。

4.根据权利要求1所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，用混合培养基将稳定表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞、稳定表达红色荧光蛋白的内皮细胞和DAPI染色的肿瘤相关成纤维细胞按比例重悬至5.2×10⁵个/ml，吸取500μl细胞悬液接种于小室中，待细胞沉降后，水平离心24孔板1500rpm 5min，培养48h后用移液枪将细胞球吹起，500rpm 5min离心弃上清获取宫颈癌类器官，转移至胶中，混合培养基继续培养。

5.根据权利要求4所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，混合培养基由DMEM/F12和ECM组成，其体积比为1：1。

6.根据权利要求3所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，将宫颈鳞癌、腺癌组织石蜡连续切片依次进行烘烤、脱蜡水化、PBS清洗、3%的H₂O₂抗原修复，山羊血清37℃封闭30min，拭去多余封闭血清后在组织上滴加相应一抗，4℃过夜孵化，PBS清洗3次后加入二抗37℃孵育30min，PBS清洗3次后加入DAB显色并滴入苏木素复染，脱水封片，利用ImageJ软件分别计算上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞细胞的面积，最终确定稳定表达绿色荧光蛋白的宫颈癌上皮细胞系、稳定表达红色荧光蛋白的内皮细胞以及DAPI染色的肿瘤相关成纤维细胞的混合比例为9:1:3。

7.根据权利要求6所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，免疫组化所用一抗用通用抗体稀释液按如下浓度倍数稀释：anti-pan-Cytokeratin 1：250，anti-vimentin 1:100，anti-CD31 1:200。

8.根据权利要求1所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，还包括一个验证相关分子表达的步骤，根据单细胞测序筛选宫颈癌相关基因，进行分子验证，证实含有上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的宫颈癌混合细胞3D类器官的仿生性。

9.根据权利要求8所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，宫颈癌侵袭相关分子为CDC42, RHOA, ROCK1 和MMP7；腺癌与鳞癌差异表达的分子包括KRT14, S100A8, CLDN3 和TP63，上述分子相关的上下游引物序列如SEQ ID NO.1~18所示；分子验证是通过对比宫颈癌上皮细胞经典2D细胞培养及宫颈癌类器官培养中上述宫颈癌相关分子的mRNA表达水平。

10.根据权利要求8所述的一种宫颈癌混合结构细胞3D类器官的制备方法，其特征在于，宫颈癌上皮细胞为人永生化宫颈鳞癌细胞系SiHa和宫颈腺癌细胞系HeLa，内皮细胞为人脐静脉内皮细胞，肿瘤相关成纤维细胞为宫颈癌患者病灶中原代提取的成纤维细胞。