[发明专利]基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒

说明书

本发明是一种试剂盒，特别涉及基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒。在基于前列腺癌相关基因的基础上，联合环介导恒温扩增(LAMP)和CRISPR体系构建检测PCA3基因的平台，具体为利用LAMP特异扩增PCA3基因产生的扩增产物在crRNA的引导下激活Cas12a的附属切割活性使同时标记了FAM荧光基团和淬灭基团的单链DNA解离释放出可以明显的荧光信号从而实现前列腺相关基因PCA3检测的方法。

技术领域

本发明是一种试剂盒，特别涉及基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，近10年来我国前列腺癌的发病率、病死率呈大幅上升趋势，已成为影响我国男性健康的重要疾病之一。

目前，临床上最常用的PCa初步诊断方法是直肠指诊(digital-rectalexamination，DRE)联合血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)检测，诊断的金标准为前列腺病理穿刺活检，然而是否行前列腺病理穿刺活检，则很大程度上取决于DRE和血清PSA的检测结果。DRE检查会让患者感觉不适，且检查结果的判断主要依赖于医生的自身经验，具有相当的主观性。

血清前列腺特异性抗原(PSA)是临床最常用的前列腺癌诊断标记物。血清PSA检测虽应用广泛，但仍存在以下缺陷：(1)PSA是前列腺组织特异性标志物，不具有前列腺癌组织特异性。并非所有PCa患者血清PSA均升高，而血清PSA升高也并不能均诊断为PCa，如前列腺炎、良性前列腺增生、急性尿潴留及相关前列腺检查等均可引起血清PSA升高；(2)血清PSA的高低与PCa恶性程度无关，很多低PSA性PCa被诊断即证实了这一点；(3)如降低诊断PCa的血清PSA阈值则明显增加了临床前列腺穿刺活检率，导致PCa阴性诊断率上升至70％～80％，带来更多不必要的前列腺穿刺活检，大大增加了患者的身体痛苦以及精神和经济负担。

DD3(differential display code 3，DD3)又名PCA3(prostate cancer 3，PCA3)，是一种具有PCa组织特异性的非编码mRNA，用RT-PCR方法研究发现PCA3在正常前列腺组织中表达较低，而在前列腺癌组织极高表达，表明PCA3具有很高的前列腺组织特异性。应用定量RT-PCR也发现前列腺癌区域PCA3的表达水平是邻近良性组织的6～1500倍。

现有技术中已经有通过分子手段检测前列腺癌的相关基因的试剂盒，这些试剂盒大都依赖于聚合酶链式反应(PCR)，PCR反应的进行又依赖于温度的升降，需要配备昂贵的控温仪器使用，比如PCR仪等，其使用受到场地等的限制，一般只在医院或者是检测中心使用，与普通百姓的日常生活并不贴近。

因此，希望能够提供一个能随时随地，操作简单，结果读出方便的家庭式检测前列腺癌的试剂盒。

环介导等温扩增(LAMP)不需要模板的热变性，在等温条件下就可以扩增，有水浴锅或金属浴就可以操作，不需要昂贵的仪器设备，且结果可视。具有省时、易操作、低成本的特性。常规用于LAMP检测的方法主要包括实时荧光采集和凝胶电泳，前者需要精密的荧光采集装置，后者操作时间长，两者在现场检测领域都受到一定的限制。可视化检测法具有操作方便、结果直观等优点，在现场检测领域具有巨大的优势。LAMP体系中各成分(如焦磷酸根离子、镁离子、氢离子等)在反应前后发生较大幅度变化，常被用于判断LAMP反应进程的可视化方法，例如HNB法、钙黄绿素法、浊度法、pH染料法等。此类方法无法排除非特异性扩增的核酸链延伸所产生的干扰，进而影响检测准确性。