[发明专利]基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒

权利要求书

1.基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒，其特征在于按以下步骤进行：

PCA3基因的环介导恒温扩增检测作为引物；

对应PCA3基因引物扩增产物的crRNA；

该试剂盒包括用于显示PCA3核酸阳性扩增结果的报告子，以及上述特异扩增PCA3基因部分片段的LAMP引物以及对应PCA3基因LAMP扩增序列的一段crRNA序列。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a耦联环介导恒温扩增的快速检测PCA3基因的试剂盒，其特征在于：

(一)、LAMP引物设计与筛选：

从NCBI下载PCA3的基因序列(Gene ID 50652)，PCA3基因包含4个外显子，根据相关文献报道及参考国外FDA批准的Progensa PCA3产品，与前列腺癌高度相关的PCA3位点在exon3与exon4之间，选取跨第3和第4内含子的部分序列基因即19270-19452和19681-20040位序列，提交至https：//primerexplorer.jp/e/网站进行LAMP引物设计，共设计了3对引物；

跨第3第4内含子的序列(划线部分为扩增序列)：

5’--gtgagaaataagaaaggctgctgactttaccatctgaggccacacatctgctgaaatggagataattaacatcactagaaacagcaagatgacaatataatgtctaagtagtgacatgtttttgcacatttccagcccctttaaatatccacacacacaggaagcacaaaaggaagcacagagatccctgggagaaatgcccggccgccatcttgggtcatcgatgagcctcgccctgtgcctggtcccgcttgtgagggaaggacattagaaaatgaattgatgtgttccttaaaggatgggcaggaaaacagatcctgttgtggatatttatttgaacgggattacagatttgaaatgaagtcacaaagtgagcattaccaatgagaggaaaacagacgagaaaatCttgatggcttcacaagaCatgcaacaaacaaaatggaatactg tgatgacatgaggcagccaagctggggaggagataaccacggggcagagggtcaggattctggccctgctgcctaaactgtgcgttcataa--3’

所述的引物如下：

第一组：

F3：5′-ATCCACACACACAGGAAG-3′

B3：5′-TGCTCACTTTGTGACTTCA-3′

FIP：5′-CTCATCGATGACCCAAGATGGCCACAAAAGGAAGCACAGAG-3′

BIP：5’-GTGAGGGAAGGACATTAGAAAATGATCAAATAAATATCCACAACAGGATC-3′

LF：5′-CGGGCATTTCTCCCAGGGAT-3′

LB：5′-TTCCTTAAAGGATGGGCAGGA-3′

第二组：

F3：5′-AGCAAGATGACAATATAATGTCT-3′

B3：5′-CATCCTTTAAGGAACACATCAA-3′

FIP：5′-TCTGTGCTTCCTTTTGTGCTTCACATGTTTTTGCACATTTCCA-3′

BIP：5′-CGCCATCTTGGGTCATCGATTTCTAATGTCCTTCCCTCAC′

LF：5′-TGTGTGTGGATATTTAAAGGGGC-3′

LB：5′-TGTGCCTGGTCCCGCTT-3′

第三组：

F3：5′-GCTCAAGAGGTTCAAAATCC-3’

B3：5’-TGAGGCGTAATCAGTCATC-3′

FIP：5′-TGCTGTTCAGTGCAATCAGTAATATACTCATTATCTTCTCTTTCTTTCAC-3′

BIP：5′-TCCCCAATGTAGCCATGCAACTTCTGGCTTCAGCAGTC-3′

LF：5′-AGGGAGAGGAGCAGGGA-3′

LB：5’-CCAGTGGCTCCTTGTGGT-3’

(二)、crRNA的设计：

将每组引物的扩增序列提交至https：//wWw.benchling.com/crispr/网站进行crRNA序列的设计；

针对上述几组引物扩增的序列分别设计了crRNA，如下：

第一组：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAUCUGUAAUCCCGUUCAA

第二组：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAUGAAGUCACAAAGUGAG

第三组：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCCAGGGAUCUCUGUGCUU

(三)、LAMP引物以及crRNA的筛选步骤：

LAMP引物以及crRNA的筛选步骤为：1)使用各组引物分别去扩增带目标序列基因的质粒DNA，选取扩增效率高扩增效果好的引物对进行下一步筛选，进行筛选的三条引物的扩增效率都较好；2)将扩增体系与CRISPR切割体系联合，观察每组引物扩增的产物是否能够在对应的crRNA的引导下激活Cas12a蛋白，使其发挥出其侧切活性切割体系中存在的所有单链DNA；剔除的两组引物和对应的两条crRNA是由于引物的扩增产物和对应的crRNA与Cas12a结合后无法很好的区分出阴阳性样品；引物经过筛选之后最优引物以及crRNA见表1，引物和crRNA在序列中的分布；

表1用于LAMP扩增PCA3基因的序列以及crRNA的序列

(四)、试剂盒的组成：

1)、引物混合试剂：

1.6μM PCA3-FIP和PCA3-BIP、0.2μM PCA3-F3和PCA3-B3、0.4μM PCA3-LF和PCA3-LB；

2)、LAMP-CRISPR试剂：

1×ThermoPol buffer、1.4mM dNTPs、6mM Mg²⁺、0.16U Bst大片段DNA聚合酶、200nMCas12a、600nM crRNA、2.5μM reporter、1×NEBuffer 2.1；

3)、阳性质控品：

200ng/μL前列腺癌阳性细胞LNCaP基因组DNA，经亚硫酸盐转化及纯化回收，即得到阳性质控品；

4)、阴性质控品：

分装的超纯水。