[发明专利]一种活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针、制备方法及其应用

说明书

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针、制备方法及其应用，以二氰基异佛尔酮为荧光团，选用缩硫酮和甲酸两种小分子分别与二氰基异佛尔酮通过缩合反应，制备得到探针DCN‑SS‑R和DCN‑C。本发明荧光探针DCN‑SS‑R和DCN‑C的荧光发射均不受溶剂极性的影响，仅与环境粘度成正相关，并具有灵敏度高，线性范围宽，pH稳定性强，生物相容性好等特点，以及对活性氧表现出显著的耐受性；在线粒体/溶酶体共定位实验中，探针DCN‑SS‑R和DCN‑C对线粒体均具有良好的靶向特性，可实现时时监测线粒体中的粘度波动，在生物检测和线粒体粘度相关疾病诊断方面具有重要的应用前景。

技术领域

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针、制备方法及其应用。

背景技术

细胞内粘度是一个研究细胞正常生理活动的重要参数并且与多种疾病(如：糖尿病、阿尔兹海默症、高血压以及多种肿瘤等)的发生和发展息息相关。在细胞水平上，粘度的波动会显著影响细胞内物质的迁移和扩散速率，进而影响细胞内的信号传导以及生物大分子之间的相互作用。目前已经有多种检测工具被用于细胞内整体粘度的检测，例如毛细管粘度计、落球粘度计、粘度测定用旋转粘度计以及粘度响应荧光探针。但是，由于细胞是一个高度不均匀的微环境，其中不同区域(尤其在不同细胞器中)的局部粘度差异显著。因此，针对细胞内某个特定的细胞器粘度实现时时监测能够更加准确的阐述粘度和细胞正常生理活动的相关性。线粒体作为细胞的能量代谢场所，参与调节细胞的各种功能。当线粒体基质中的粘度发生变化时，会通过线粒体内外的渗透压改变其代谢物的扩散，进而影响线粒体的正常代谢。因此，开发一种可以有效时时监测线粒体内粘度变化的工具具有重要的生物医学价值。

荧光成像技术近年来发展十分迅速，由于其高分辨率、高选择性和高灵敏度、可实时监测等优点已被广泛应用于线粒体内粘度的检测。但是，目前已报道的用于线粒体粘度时时监测的荧光探针仍然在稳定性方面存在着一定的缺陷。这主要由于线粒体是能量代谢的场所，在代谢的过程中会产生大量的活性氧(ROS)，过量的ROS往往会导致许多荧光探针结构发生变化进而荧光强度大幅降低，这一现象又被叫做荧光淬灭作用。因此，开发一种ROS耐受性好、量子产率高、线粒体靶向性优异的荧光探针在线粒体粘度相关疾病诊断及机理研究方面具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于解决如何通过基于二氰基异佛尔酮的荧光探针对线粒体内的粘度进行动态测定的问题，提供了一种活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针、制备方法及其应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针(DCN-SS-R和DCN-C)，所述荧光探针为(E)-2-((2-((2-羟乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基-(4-(2-(3-(二氰亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)氨基甲酸酯(DCN-SS-R)或(E)-N-(4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)甲酰胺(DCN-C)，所述DCN-SS-R的结构式如下：

所述DCN-C的结构式如下：

本发明还公开了上述活性氧耐受的二氰基异佛尔酮荧光探针中DCN-SS-R的制备方法，合成路线如下：

化合物二氰基异佛尔酮与2,2-双-(2-羟基乙基磺酰胺基)-丙烷，在缩合剂与缚酸剂的作用下，化合物二氰基异佛尔酮和缩合剂制备混合体系，混合体系再和2,2-双-(2-羟基乙基磺酰胺基)-丙烷进行于有机溶剂中反应得到目标探针DCN-SS-R。

所述缚酸剂可独立选自N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、乙二胺、无水碳酸钾、无水碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂或1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，其中优选：N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺。