[发明专利]一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。本发明通过敲除质粒同源重组、插入回补质粒以及环出敲除质粒三步法方案来构建基于自杀质粒的细菌必需基因的缺失突变菌株。利用该方法，以铜绿假单胞菌PA0006基因作为目的基因，团队详细研究了假单胞菌必需基因PA0006的功能与抑制分析，结合显微观察、免疫印迹、转录组测序与DNA重测序等技术发现PA0006在细胞形态和脂多糖核心寡糖的生物合成中发挥着调节作用。PA0006基因也是开发治疗和预防铜绿假单胞菌引起疾病的新药靶标。与现有技术对比，本发明简单、快速、有效，方法可广泛应用于细菌必需基因的表型和抑制分析。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。

背景技术

微生物必需基因是那些在丰富培养基中编码细胞生长不可缺少的功能的基因。转座子插入测序(Tn-seq)技术允许在微生物基因组水平上通过插入排除来鉴定必需基因，目前通过使用Tn-seq方法，已经在铜绿假单胞菌PAO1中提出了近350个必需基因，对铜绿假单胞菌的必需基因进行了全面的基因组研究，为挖掘细胞生长所必需的新生物过程和新药开发的目标提供了资源。然而这些必需基因的抑制性分析尚未完成，350个必需基因中超过15.7％被归类为编码假设蛋白或保守假设蛋白，现有技术中缺乏构建铜绿假单胞菌必需基因条件等位基因型的系统方法。

可调控的启动子，如依赖阿拉伯糖的P_BAD启动子和杂合的trp-lac启动子P_tac，常通过控制它们的转录水平用于必需基因的分析。最近，利用dead-Cas9(dCas)介导的抑制靶基因转录的CRISPR干涉(CRISPRi)技术已被报道用于大规模研究枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌的必需基因。然而，CRISPRi介导的突变体倾向于在dCas9中积累突变，导致长时间生长后转录抑制缺失。因此，转录调控介导的突变不适合用于必需基因的抑制因子分析。

授权公告号为CN109777830B、授权公告日为2022年5月20日的中国专利公开了一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，构建双质粒系统：敲除质粒(KO质粒)和营救质粒(Rescue质粒)，将两个质粒同时转入细胞后用药筛若干天，分选单克隆，通过测序鉴定，获得必需基因纯合敲除细胞系。许多必需基因在酵母中被发现是可抑制的。通过使用互补质粒的条件致死基因，必需基因抑制性的系统分析已经鉴定出7-17％的必需基因在酵母中是可抑制的。酵母中必需基因的缺失等位基因可以在二倍体细胞中构建成有活力的杂合子。引入回补质粒后，诱导杂合二倍体细胞形成孢子，产生单倍体孢子或含有带有回补质粒的缺失等位基因的细胞。然而，这些方法不适用于细菌细胞。

发明内容

为了解决现有技术中缺乏对必需基因进行反向遗传分析的方法的技术问题，本发明提出了一种对细菌中必需基因进行反向遗传分析的方法。本发明简单、快速、有效，能达到对细菌中必需基因进行反向遗传分析的效果。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种对必需基因进行反向遗传分析的方法，包括以下步骤：

(1)向细菌细胞中引入含有缺失目的基因等位基因片段的敲除质粒，筛选出敲除质粒通过单交换同源重组整合到细菌细胞染色体中的细菌细胞；

(2)转化含有目的基因自身启动子及其控制的野生型等位基因片段的回补质粒，筛选出含有回补质粒的细菌细胞；

(3)通过环出效应切除细菌细胞基因组中的部分片段，而后筛选出切除了目的基因并保留缺失目的基因等位基因的细菌细胞；

(4)对缺失突变体细胞控制表达并观察表型，进行表型评估和抑制性分析。

作为优选，所述方法具体包括以下步骤：