[发明专利]一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测方法及试剂盒

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于SARS‑CoV‑2的可视化核酸检测方法及试剂盒。本发明提供了一种可视化、简易操作的核酸检测方法(试剂或试剂盒)，该方法基于环介导等温扩增的原理，在60‑65℃进行反应，然后通过样品颜色变化判断结果。该方法无需提取核酸，初始样品可以是取样的拭子，只需要一个恒温加热装置(金属浴，水浴)，一步加样，30分钟内即可判读结果，检测结果可以通过肉眼可分辨的颜色或紫外吸收光谱颜色的变化来判读。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测方法及试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2，亦被称为2019-nCoV、HCoV-19)属于β属的冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形直径60nm～140nm，基因特征与SARS具有明显的区别，且相比于SARS具有更高的感染能力。基于流行病学调查，COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。因此，如何快速确诊疑似病例，以及如何有效监控疾病进程，成为治疗COVID-19，打好疫情攻坚战的重点。

SARS-COV-2的快速检测对当前世界上疫情的控制具有突出的贡献。目前市场上对2019-Ncov的主要检测方法包括核酸检测，抗体和抗原检测。其中，核酸检测的一般步骤是：取样—提取核酸—反转录-定量PCR，整个检测过程需要专业的仪器(全自动核酸提取仪，定量PCR仪)，专业的操作人员(操作步骤多)，平均耗时3小时以上才能拿到结果。

抗体检测主要是检测已经感染人员血液中的IgM和IgG，然而，抗体只有在感染几天之后才逐渐出现。抗原检测需要时间短，可以实现自主检测，但检测灵敏度有限。因此，有必要开发一种操作简单、无需专业仪器、灵敏度高，且耗时短的SARS-COV-2核酸检测方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明一种基于环介导等温扩增原理的SARS-COV-2核酸检测方法(试剂或试剂盒)，能够直接使用咽拭子样品，无需提取核酸，一步加样操作，30分钟内特异性检测SARS-COV-2核酸。所需设备极度简化，只需要一个恒温加热装置，检测结果可以通过肉眼可分辨的颜色来判读。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测试剂，所述试剂包括(NH₄)₂SO₄，KCl，MgSO₄，促核酸释放试剂，dNTP，SARS-CoV-2的N基因LAMP引物，Bst DNA聚合酶大片段，逆转录酶和显色试剂，所述显色试剂为pH或者镁离子响应的显色试剂。

作为本发明的一个优选实施方式，所述试剂共20～30μL，包含10mM(NH₄)₂SO₄，50mMKCl，8mM MgSO₄，0.2～1.0％促核酸释放试剂，2～20mMdNTP，6条0.1～1.6μM N基因LAMP引物，200～800ng/μLBst DNA聚合酶大片段，0.2～20ng/μL逆转录酶和0.2～0.6mg/mL显色试剂，所述显色试剂为间甲酚紫与偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者溴百里酚蓝与偶氮胂I的混合液。

优选地，所述显色试剂为0.2mg/mL间甲酚紫与0.2mg/mL偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者0.4mg/mL溴百里酚蓝与0.2mg/mL偶氮胂I的混合液。

优选地，所述N基因LAMP引物包括N gene引物组合，或ORF 1ab基因引物组合，或者人基因RPLP0引物组合，所述N gene引物组合如SEQ ID NO：1～6所示，所述ORF 1ab基因引物组合如SEQ ID NO：7～12所示，所述人基因RPLP0引物组合。