[发明专利]一种正交线性基因表达系统及其应用

说明书

本发明公开了一种正交线性基因表达系统及应用，属于基因工程领域。本发明是以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为表达宿主，通过在胞内构建线性质粒，实现了基因的稳定表达。同时，本发明还实现了线性质粒拷贝数的精确控制。这不仅在苏云金芽孢杆菌内开发了一个稳定的蛋白表达系统，还为苏云金芽孢杆菌合成生物学应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种正交线性基因表达系统及其应用。

背景技术

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，广泛存在于许多生物中，它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性等。质粒DNA有三种构象，大部分质粒DNA通常呈现超螺旋的SC构型，其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，也称为共价闭合环形DNA(cccDNA)；当两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，也称为开环DNA(ocDNA)；当质粒DNA经过限制性内切酶等核酸酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子(lDNA)。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)作为革兰氏阳性微生物，在农业上被广泛用作生物农药。此外，作为通常认为安全的微生物，其生长速度快，在合成生物学领域的应用具有巨大潜力，适合作为蛋白表达和代谢工程的宿主。然而，目前对其工具的开发仍然有限。此外，目前已有的细菌质粒均为环形质粒，尚未开发出线性的DNA质粒。相比于环形质粒，线性质粒具有正交、可控拷贝数、复制稳定不易丢失等诸多优点。因此，为了酶工程、代谢工程等领域的发展打下基础，本发明旨在实现一种适用于苏云金芽孢杆菌的线性质粒的开发与应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种适用于苏云金芽孢杆菌的正交线性基因表达载体，是将溶源性线性双链DNA噬菌体基因组改造后获得的能够表达目的基因的载体，并将其应用于蛋白的稳定表达。

本发明的第一个目的是提供一种正交线性基因表达系统，该基因表达系统包括以下I或II：

I、含有左复制原点、启动子、目的基因和右复制原点的第一质粒，以及含有DNA复制与控制基因簇的第二质粒；

II、同时含有左复制原点、DNA复制与控制基因簇、启动子、目的基因和右复制原点的第三质粒；

其中，当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.1时，所述右复制原点的序列为SEQID NO.2，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.3；

当所述左复制原点的序列为SEQ ID NO.4时，所述右复制原点的序列为SEQ IDNO.5，所述DNA复制与控制基因簇的序列为SEQ ID NO.6。

具体地，SEQ ID NO.1序列为：

ATTATGTACCTCTACTAGCCTATTAAAATATTTACCTATTGACACGTAATAACATTTATGAAATATGATATAC；

SEQ ID NO.2序列为：

TATATCGTGAAACATAGATGTTTATTTGTGTCAATGGGTAATATTGGTAAAAGTGCTAGTAGGGATACATAATA；

SEQ ID NO.4序列为：

ATTATGTACCCCTACCAACCTATTAAAATATTTACCTATTGACATGTAATAACATTTATGAAACACGATATAC；

SEQ ID NO.5序列为：

TATATCGTGTTTCATAGATGTTTATTTTTGTCAATGGGTAAATATGGTAAAGGTGCTAGTAGGGGTACATAAT。