[发明专利]一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒及其使用方法

说明书

本申请提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、荧光染料；所述荧光染料为钙黄绿素－Mn²⁺染料。本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强，速度快，20min即可获得结果。现有检测体系非常容易遭到污染，主要原因是开盖后终端产物造成的气溶胶污染，在上述反应体系中加入钙黄绿素和Mn²⁺，配合新型指示剂能够在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显，可以避免开盖污染。此外还提出了荧光量化的技术支持，通过酶标仪测反应后荧光值使得最终结果可以实现仪器化检测。

技术领域

本发明提供了一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒及其使用方法，属于病毒检测技术领域。

背景技术

受到新冠不同变异毒株的影响，全球新冠新增确诊病例数历经了数次起伏，一直未能得到完全控制。近期，随着奥密克戎新型变异毒株的出现，全球新增确诊数再次上扬，其中，欧美地区新增确诊病例数量明显上升。

新型冠状病毒具有极强的传染性、人群普遍易感、具有潜伏期，因此需要及时地发现感染者、控制传染源，切断传播途径，才能有效地控制疫情的蔓延。而采取一切阻断措施的前提是需要有快速、准确、灵敏的诊断。

目前，国内外市面上有很多新型冠状病毒检测的试剂盒，主要基于两种方法：免疫学方法和分子生物学方法。其中，基于免疫学的方法主要是采用胶体金方法、化学发光法和酶联免疫法，检测患者血清或血浆中的新型冠状病毒特异性IgM抗体、IgG抗体或抗原。但是，临床上一般不单独以血清学检测作为诊断依据，灵敏度和特异性有限，几乎无法检测潜伏期和感染初期的病人，难以作为新冠感染确诊和排除的准确依据，同时抗体检测容易受到血液标本中的一些干扰物质(如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等)的存在而出现“假阳性”结果。而基于分子生物学的方法主要是采用实时荧光PCR技术，特异性检测患者咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物等标本中的新型冠状病毒核酸。临床上将核酸检测结果作为诊断的依据之一，但基于PCR技术的检测方法存在一定的漏检率，准确率不同公司差异较大，RT-PCR存在操作复杂，对设备依赖性高，需要专业的技术人员，检测时间长，目前市面上基本都是采用荧光定量PCR鉴定新型冠状病毒，从样本采集到得到检测结果，整个检测流程在4个小时以上。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi发明的一种核酸体外恒温扩增技术。其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异性引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单、结果易于判读等特点。当前，中国博奥生物公司推出的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)是目前少数采用恒温扩增技术检测SARS-CoV2的产品，但是该产品仍然需要配备相应的设备进行检测，且检测前需要进行病毒RNA的提取，很难做到真正意义上的现场检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出提供一种环介导等温扩增新型冠状病毒核酸检测的方法及试剂盒，本发明能够检测出2019新型冠状病毒基因序列中的2019-nCoV N基因片段，具有操作简单、可重复性强、灵敏度高、特异性好、检测结果快速客观等优点，为新型冠状病毒确诊提供新的科学依据。本发明技术方案如下：

一种新型冠状病毒环介导等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括引物组、DNA聚合酶、LAMP反应液、荧光染料；

所述荧光染料为钙黄绿素－Mn²⁺染料。

可选的，所述引物组包括一对外引物F3和B3、一对内引物FIP和BIP、一对环引物LoopF和LoopB，核苷酸序列分别如下所示：

F3:AGATCACATTGGCACCCG

B3:CCATTGCCAGCCATTCTAGC