[发明专利]一种细胞冻干保存剂及其制备方法在审

专利信息
申请号: 202210855857.6 申请日: 2022-07-19
公开(公告)号: CN115024310A 公开(公告)日: 2022-09-09
发明(设计)人: 刘亮;徐芳;柴国梁 申请(专利权)人: 首都医科大学宣武医院
主分类号: A01N1/02 分类号: A01N1/02;C12N5/10;C12N15/12
代理公司: 北京之于行知识产权代理有限公司 11767 代理人: 韩岳
地址: 100053*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 一种 细胞 保存 及其 制备 方法
【说明书】:

发明涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法,该细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂,冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物,糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合,聚合物能够是白蛋白,该冻干保护剂还包括支撑物,支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架,使细胞能够粘附在玻片上,并保护细胞的完整性,其中,支撑物能够是低熔点琼脂糖。该细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4‑羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域,尤其涉及一种细胞冻干保存剂及其制备方法。

背景技术

基于细胞转染的间接荧光法(CBA)一直是自身免疫疾病的主要检测手段,利用细胞表达全长抗原蛋白,并完成蛋白折叠等蛋白修饰,能够最大程度体现抗原天然空间构象,有利于抗原和抗体反应,因此CBA法的灵敏度、特异度明显高于其他检测方法,例如Elisa。CBA法检测常见于实验室,但是做成产品需要克服细胞无法长期保存的问题。

在生物制品的冷冻干燥过程中,主要有三种效应会导致生物制品中活性组分的变性:低温效应、冻结效应和脱水效应。低温效应,生物制品中活性组分在降温与复温过程的一定温度范围内会发生变性。如对卵清蛋白(ovalbumin)的研究发现,在-10℃~-40℃之间,其活性显著降低,而继续降温到在-192℃,活性几乎没有变化;冻结效应(包括离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH值变化以及相分离等),在生物制品的冻结过程中,不断结晶会导致溶液的浓度快速升高。小分子糖在最大冻结浓缩基质中的计算浓度高达80%。当溶液浓度发生变化时,离子浓度增加,促进了化学反应。在生物制品溶液在冻结过程中也会产生大量的冰-水界面。其中活性组分分子,如蛋白质,可能会被吸附到界面上,从而可能破坏蛋白质的天然褶皱结构,最终导致蛋白质变性。在有些生物制品溶液的冻结过程中,溶液的pH值也会发生变化。如在添加有pH值为7的磷酸盐缓冲液(NaH2PO4和Na2HPO4的摩尔比为0.72)的蛋白质溶液冻结过程中,由于NaH2PO4的溶解度远远大于Na2HPO4,当溶液达到三相共晶点时,它们之间的摩尔比为57,最终导致了pH值的很大改变。蛋白质发生物理聚集和化学变性。脱水效应:水溶液中蛋白质经过充分水合作用后,在蛋白质分子表面附着一单层水,这就是所说的水合层(hydration shell)。一般来讲,参与完全水合作用的水含量为0.3~0.35g(水)/g(蛋白质)。而在冻干蛋白质产品中水的含量一般不超过10%,因此,必定有一部分结合水在干燥过程中被除去。结合水的去除很可能破坏蛋白质的天然结构,最终导致蛋白质变性。这是因为富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在乏水环境中,将质子转化为带电羧酸基团,破坏了蛋白质中电荷平衡,电荷密度的降低可能促进蛋白质分子之间的疏水作用,从而使蛋白质发生聚集。

低分子量化合物:又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等;中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L-苏氨酸、肌醇、木糖醇等;碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。高分子化合物:主要如白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等以及天然混合物如脱脂牛奶、血清等。一般认为,低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用;而高分子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此,制备保护剂配方时,一般多将低、高分子化合物配合使用。

冻干保护剂(lyoprotectant):在冻结和干燥过程中,可以防止活性组分发生变性的物质,如甘油、二甲亚砜(DMSO)、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等;

抗氧化剂(antioxidant):用作防止生物制品在冷冻干燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质的物质,如维生素D、维生素E、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等,将不同的抗氧化剂混合起来使用,比单独使用时,具有更高的效力,即混合抗氧化剂具有增效的作用。

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