[发明专利]一种细胞冻干保存剂及其制备方法

权利要求书

1.一种细胞冻干保存剂，所述细胞冻干保存剂包括能够与生物制品活性组分的分子形成氢键的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括糖类物质和用于促进糖类的保护作用的聚合物，所述糖类物质为海藻糖、蔗糖中的一种或两种组合，所述聚合物能够是白蛋白，其特征在于，所述冻干保护剂还包括支撑物，所述支撑物能够为细胞提供网格状的透明的支架，使细胞能够粘附在玻片上，并保护细胞的完整性，其中，所述支撑物能够是低熔点琼脂糖。

2.根据权利要求1所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于维持溶液pH值的冻干缓冲液、所述冻干缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中的一种或者多种组合。

3.根据权利要求1或2所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂还包括填充剂，所述填充剂能够为细胞的活性组分提供支撑结构，其中，所述填充剂能够是多元醇。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂还包括用于防止冻干样品变质的防腐剂，所述防腐剂能够穿透细胞膜，进而抑制对微生物呼吸至关重要的特定酶，以达到抑制微生物活性的目的。

5.根据权利要求1～4任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述冻干保护剂中，所述糖类物质与总质量的质量比为5％-8％，所述聚合物与总质量的质量比为1％-5％，所述多元醇与总质量的质量比为1％-3％，所述防腐剂与总质量的质量比为0.05％，所述低熔点琼脂糖浓度为0.1％。

6.根据权利要求1～5任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述细胞冻干保存剂经其和固定的细胞共孵育并真空冷冻干燥获得，其中，所述细胞为表达外源基因的HEK293T细胞或者Hela细胞。

7.根据权利要求1～6任一项所述的一种细胞冻干保存剂，其特征在于，所述外源基因包括自身免疫性疾病相关抗原蛋白。

8.一种基于根据权利要求1～7任一项所述的一种细胞冻干保存剂的细胞冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：细胞的培养：将表达外源基因的细胞接种到处理好的玻璃板上；细胞的固定：使用4％PFA或者100％甲醇或者丙酮进行固定；细胞冻干保存剂的制备：在冻干缓冲液的基础上，按比例添加冻干保护剂和防腐剂，充分混匀，并用滤膜过滤；真空冷冻干燥：将步骤固定的细胞和所述细胞冻干保存剂共孵育，进行-60℃～-50℃预冻、-50℃～-40℃主冻干、-50℃～-40℃后冻干。

9.一种基于根据权利要求1～7任一项所述的一种细胞冻干保存剂的预冻过程的温度控制方法，其特征在于，包括以下步骤：在固定的细胞和所述细胞冻干保存剂混合后，取样测定温度曲线，根据所述温度曲线得出预冻时的第一梯度温度T₁；检测细胞与细胞冻干保存剂冻干前的温度为T₀，并计算所述第一温度梯度T₁与所述细胞与细胞冻干保存剂的温度T₀的差值，当所述第一温度梯度T₁与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T₀的差值为70℃以下时，延长预冻时间至少1.5h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T₀的差值为70～75℃时，延长所述预冻时间至少1h，当所述第一温度梯度与所述细胞与细胞冻干保存剂预冻前的温度T₀的差值为80℃以上时，延长预冻时间至少0.5h。

10.根据权利要求9所述的一种预冻过程的温度控制方法，其特征在于，包括以下步骤：检测冻干机搁板间的温差，当温差小于1℃时，所述冻干机维持原本冻干时间；当所述温差大于1℃，则每超过1℃增加至少0.5h冻干时间；在所述细胞与细胞冻干保存剂达到所述第一温度梯度T₁后，将预冷温度下调至第二温度梯度T₂，其中，低于所述第二温度梯度T₂低于所述细胞与细胞冻干保存剂的共晶点的温度，所述第一温度梯度T₁大于所述第二温度梯度T₂。