[发明专利]配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途

说明书

本发明涉及细胞培养领域，公开了一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途。该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体、CD16单克隆抗体以及相对于每纳克的CD335单克隆抗体含量为10‑40IU的人白介素2和含量为0.6‑2.4ng的人白介素15，能够不依赖使用胎牛血清作为培养基提供营养物质，使得制备的犬自然杀伤细胞安全且能高效扩增，并避免了异源性蛋白、外源性病毒和其他致病因子导致的致病和污染、不可量产以及易过敏的缺陷，更好的应用于宠物临床细胞治疗，减小宠物临床治疗的风险。

技术领域

本发明涉及细胞体外培养领域，具体涉及一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其用途。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)作为机体重要的免疫细胞。在肿瘤免疫治疗，病毒疾病免疫治疗，抗衰老治疗中发挥重要作用。在临床应用中，通过培养外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得NK细胞，体外培养可以扩增并纯化NK细胞，使其达到临床应用的数量和纯度要求。

NK细胞的体外培养方法主要有饲养层细胞共培养法和单纯细胞因子刺激法。其中，单纯细胞因子刺激法是指在不使用饲养层细胞共培养的情况下，加入相应细胞因子，使PBMC中的NK细胞激活并增殖。但是，单纯细胞因子刺激法使用的培养系统中，往往依赖于胎牛血清或者小牛血清。胎牛血清或者小牛血清含有丰富的细胞生长增殖必需的营养成分，如生长因子、激素类物质等，可促进NK细胞存活生长和增殖，并维持NK细胞功能。

基于胎牛血清或者小牛血清存在上述优点，因此现有的制备临床用犬NK细胞的方法多依赖于胎牛血清或者小牛血清。但是，胎牛血清或者小牛血清的使用还是给制备符合临床要求的犬NK细胞带来了诸多不便。第一，不同批次的胎牛血清或小牛血清其生物活性，激素以及细胞因子存在差异，导致临床制备的犬NK细胞品质不稳定，很难做到标准化生产。第二，胎牛血清或者小牛血清中含有大量异源性蛋白，容易引起接种犬对细胞制品的过敏反应。第三，胎牛血清或者小牛血清中可能存在外源污染的病毒和致病因子带来了临床应用风险。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的使用胎牛血清或者小牛血清自然杀伤细胞品质不稳定不能标准化量产，易引起犬只过敏反应，以及可能带来外源污染的病毒和致病因子的问题，提供一种具有利用自体血浆培养临床用犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其体外培养的方法，该组合物及其体外培养的方法使用犬自体血浆替代了胎牛血清或者小牛血清，在无血清培养基中提供细胞生长所必需的物质，使细胞生长增殖。使制备的犬自然杀伤细胞安全且能高效扩增，并避免了异源性蛋白、外源性病毒和其他致病因子导致的致病和污染、不可量产以及易过敏的缺陷，更好的应用于宠物临床细胞治疗。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种配合自体血浆使用的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，其中，相对于每纳克的CD335单克隆抗体，人白介素2的含量为10-40IU，人白介素15的含量为0.6-2.4ng。

本发明第二方面提供一种利用自体血浆体外培养犬自然杀伤细胞的方法，该方法包括：将犬的自体血浆分离得到外周血单个核细胞与上述组合物混合进行激活培养。

通过上述技术方案，本发明使用犬自体血浆制备全自然杀伤细胞安全且高效，扩增倍数可达30倍以上，本发明的配方可以避免使用胎牛血清或小牛血清对犬只的伤害，达到标准易把控的效果，进一步的应用于宠物的临床治疗减小风险，减少致病因素。

附图说明

图1是金毛寻回犬NK细胞体外激活过程中不同时间的显微镜照片；

图2是金毛寻回犬NK细胞体外扩增过程中不同时间的显微镜照片；

图3是金毛寻回犬NK细胞体外扩增细胞增殖曲线；