[发明专利]一种基于核酸外切酶降解速率快速筛选适配体的方法

说明书

本发明提供了一种基于核酸外切酶降解速率快速筛选适配体的方法，配制加入适配体和靶标的反应体系，以及仅加入适配体的对照体系，加入核酸外切酶后，每隔一段时间取出部分样本加入到含有荧光染料的淬灭溶液中，检测荧光强度并比较反应体系和对照体系的相对荧光强度，间接表征适配体与靶标的结合能力。本发明可对多组适配体的亲和力进行高通量大批量的定性检测，大幅缩小了筛选周期，降低成本，有利于后续的定量检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫筛查领域，具体地说涉及一种基于核酸外切酶降解速率快速筛选适配体的方法。

背景技术

核酸适配体(Nucleic Acid Aptamer)是指能形成一定空间结构并与目标物质特异性结合的RNA或单链DNA，其目标物质范围很广，包括蛋白质、小分子、金属离子甚至全细胞等。核酸适配体是通过体外筛选得来的，通过对随机文库的多次筛选和富集，能够筛选到与靶标有高亲和力的特异性适配体。与抗体相比，适配体更加稳定，不易受到环境的影响，并且核酸适配体可以化学合成，保证序列的准确性，降低批次间差异，并且其合成成本也较低。因此以适配体为探针进行小分子检测在临床检测与治疗以及环境检测等方面受到越来越多的关注。

为满足实际应用，适配体与其对应靶标之间必须要有足够的亲和力和特异性。随着DNA测序技术的发展，可以对体外筛选获得的富集序列进行测序分析并得到数万条候选序列，这些序列对靶标的亲和力及特异性需要逐条测试。

现有的核酸适配体亲和力检测方法主要依赖于专业仪器设备，如等温滴定(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)、表面等离子共振(Surface PlasmonResonance,SPR)、微量热涌动(Microscale Thermophoresis,MST)等。通过这些专业设备可以获得适配体与靶标相互作用完整的结合参数。但这些方法一次只能检测一个适配体与靶标的相互作用，通量低、耗时长，并且仪器价格高、检测成本高，还需要有专业人员操作，不合适大规模适配体的筛选。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于核酸外切酶对偶联靶标适配体降解速率的变化来评估适配体与靶标亲和力的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种基于核酸外切酶降解速率快速筛选适配体的方法，包括：配制加入适配体和靶标的反应体系，以及仅加入适配体的对照体系；所述反应体系和对照体系孵育后，各自加入核酸外切酶混匀，从t＝0开始，每隔一段时间取出部分样本加入到含有荧光染料的淬灭溶液中，检测荧光强度，获得基于相对荧光强度的反应体系数据集和对照体系数据集；比较所述反应体系数据集和对照体系数据集。

由于核酸外切酶对适配体具有降解活性，当适配体与其靶标结合后，核酸外切酶对适配体降解到靶标结合区域时，其对适配体的降解速率会降低。适配体与靶标的结合能力越强，降解速率越慢。基于此，本发明利用特定荧光染料来监测适配体的降解情况，间接表征适配体与靶标的结合能力。

需要说明的是，所述反应体系不限于一个反应体系，可以是适配体分别与不同类型、不同浓度或不同偶联环境下形成的多个反应体系的集合。鉴于此，可以对多种适配体、多种靶标、在多种偶联环境和多个对照体系下进行大规模适配体初筛，以确定与靶标亲和力较高的适配体，为后续定量分析提供数据基础。所述反应体系和对照体系优先保证适配体能够与靶标结合；该体系对于酶活性可能不是最优的，可必要地加入DMSO、BSA和MgCl₂。

本发明所述的适配体选自包括但不限于单链DNA、单链RNA、双链DNA和双链RNA，适配体长度为优选为15-90bp。这些适配体在其对应的缓冲体系中，可形成稳定的茎环结构、发卡结构等二级结构。

本发明所述的靶标是指与既定适配体可特异性结合的小分子物质，可通过SELEX技术对适配体进行筛选，可通过氢键、分子间作用力、静电吸附或碱基堆积力等与适配体发生结合。