[发明专利]L-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了L‑乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。本发明公开的L‑乳酸脱氢酶是将SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的底物特异性提高的蛋白质。本发明提供的突变后的L‑乳酸脱氢酶提高了L‑乳酸脱氢酶的底物特异性，降低了发酵液中的2‑羟基丁酸浓度，提高了乳酸的产量，降低了分离成本，具有较高的工业应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及L-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。

背景技术

乳酸为世界三大有机酸(乙酸、柠檬酸和乳酸)之一，被美国食品和药品管理局认定为“公认安全物质(GRAS)”，广泛地应用在食品、药品、化妆品和日化中。近些年来，随着人们对白色污染问题的重视以及政府对生物可降解塑料的推行，聚乳酸的产能不断得到扩大。聚乳酸的合成步骤一般为乳酸、丙交酯、聚乳酸，作为合成聚乳酸的原料，乳酸要满足光纯和高化学纯度的要求。现有的两种乳酸生产方法，由于化学合成法的乳酸为外消旋体，不满足聚乳酸的要求，因此工业上目前生产乳酸普遍采用的方法为微生物合成法。

微生物合成法生产得到的乳酸基本可以满足丙交酯对乳酸光纯大于99％的要求，但是在发酵的过程中，微生物产生乳酸也会产生一些其他的副产物，如色素、蛋白、碳链较短的醇类、羧酸和2-羟基丁酸等。目前普遍采用的发酵液后分离路线的步骤为发酵液加入氢氧化钙或氧化钙进行碱解，使用板框过滤掉菌体以后，加入硫酸进行酸化，再次使用板框除去硫酸钙，得到的上清经过脱色、纳滤和离子交换，最后经过浓缩和分子蒸馏得到成品乳酸。一些副产物如蛋白、色素、甲酸、乙酸、乙醇和丁二酸等会在分离的过程中被除掉，而一些副产物如2-羟基丁酸由于与乳酸沸点和分子自由程较为接近，无法在上述的分离过程中得到有效的去除。这些产物残留在乳酸中会影响到下游丙交酯的合成，进一步影响聚乳酸的品质。

由于在后分离的过程中对2-羟基丁酸分离较为困难，因此最佳的方法为在上游发酵的过程中进行解决。根据报道，2-羟基丁酸的产生途径很可能为氨基酸经过氨基转移酶、D-氨基酸氧化酶或者L-氨基酸脱氨酶的作用得到α-酮酸，而α-酮酸在脱氢酶的作用下转化为2-羟基丁酸。在乳酸的发酵过程中，L-乳酸脱氢酶的活性较高，表达量较大，且具有较广的底物谱，因此α-酮酸可能被L-乳酸脱氢酶转化为2-羟基丁酸。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-乳酸脱氢酶，以提高现有的L-乳酸脱氢酶的底物特异性，降低发酵液中的2-羟基丁酸含量，提高乳酸的产量。

具体地，本发明根据大肠杆菌的密码子偏好性对来源于凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)B1821的野生型L-乳酸脱氢酶的基因(SEQ ID NO：1)进行密码子优化，合成SEQID NO:2,以提高该基因的表达效率；通过基因突变的方法在该基因中引入单点突变或多点突变，使改造之后的L-乳酸脱氢酶具有较高的底物特异性，在发酵过程中降低发酵液中的2-羟基丁酸含量，并提高乳酸的产量，以利于下游乳酸的分离。

在第一方面，本发明提供一种L-乳酸脱氢酶，其是将SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质，该蛋白质相比于未突变的SEQ ID NO:41所示的L-乳酸脱氢酶具有提高的底物特异性。

在一些实施方案中，上述L-乳酸脱氢酶中，所述L-乳酸脱氢酶是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第61、75、77、103、150、230和/或276位进行氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质；