[发明专利]一种优化环介导等温扩增反应的方法

说明书

本发明公开了一种优化环介导等温扩增反应的方法，属于生物技术领域。本发明所提供的方法为将石蜡块加入到环介导等温扩增反应体系当中进行核酸扩增，同时，在反应混合物中不包括甜菜碱。本发明方法可有效提高环介导等温扩增反应的灵敏度，并且能够抑制假阳性结果的出现、减少非特异性扩增，从而提高的检测效率。可以被应用于食品安全检测等领域，具有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种优化环介导等温扩增反应的方法。

背景技术

环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，缩写为LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15min-1h即可产生10⁹～10¹⁰倍的扩增子，若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。因此，如何优化环介导等温扩增反应体系，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，一直是该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

克服现有环介导等温扩增检测技术中所遇到的由于灵敏度高、实验环境易被气溶胶污染以及多条引物间发生非特异性结合而容易产生假阳性和灵敏度降低的问题，本发明提供一种优化环介导等温扩增反应的方法。以便进一步提高检测的灵敏度、抑制非特异性扩增，解决在环介导等温扩增检测方面遇到的技术难题。

本发明通过以下方案解决所述的技术问题：一种优化环介导等温扩增反应的方法，通过向环介导等温扩增反应体系中添加石蜡块同时避免使用甜菜碱来实现反应体系优化，包括如下步骤：

（1）在反应管底部加入反应混合物I；

（2）加入石蜡块，盖上管盖，60℃融化、冷却，其中，石蜡块的用量为：如在25µL的核酸扩增反应体系中加入石蜡块融化后的体积为8µl；

（3）加入反应混合物II；

（4）进行等温扩增反应；

（5）核酸扩增产物检测：通过电泳检测、浊度检测或显色检测。

本发明通过向环介导等温扩增反应体系中添加石蜡块，同时避免使用甜菜碱的方法来实现优化效果，提供了一种优化环介导等温扩增反应的方法。采用本发明的检测方法检测，具有高灵敏度和高特异性的优点。

进一步的，加入的石蜡块的熔点为48-50℃。

本发明方法中，反应混合物I包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、Mg²⁺ 、MnCl₂。反应混合物I不包括甜菜碱。

本发明方法中，反应混合物II包括但不限于dNTP、外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Bst DNA聚合酶、聚合酶缓冲液、Mg²⁺、MnCl₂。反应混合物II不包括甜菜碱。

本发明方法中，在一具体实施方案中，所述反应混合物包括dNTP 1.0-1.6 mmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，内引物FIP和BIP各1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，1×聚合酶缓冲液，Mg²⁺ 2-9 mmol/L。例如，1× Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/L，KCl 10 mmol/L，(NH4)₂SO410 mmol/L，0.1% Triton X-100，MgSO₄ 2 mmol/L。本发明方法中，所述等温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90 min；②80℃终止反应2~20 min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。