[发明专利]两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物

说明书

本发明公开了一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物，具体包括模板DNA提取、PCR扩增反应、琼脂糖电泳检测、结果判定四个步骤；所述的特异性PCR鉴别引物为：上游引物：5´GCTCCCGTCTCTCCGACT 3´；下游引物：5´TGACGCTTTTCCAGACTACA 3´。本发明提供的鉴别方法简单易行，客观性强，采用所述方法及鉴别引物能够快速准确的对两面针和其伪品飞龙掌血进行鉴别，从而保证两面针药材的临床疗效和用药安全，有利于两面针药材市场的健康发展。

技术领域

本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物。

背景技术

两面针为芸香科花椒属植物两面针Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC的干燥根，具有行气止痛、活血化瘀、祛风通络的功效。用于气滞血瘀引起的跌打损伤、风湿痹痛、胃痛、牙痛，毒蛇咬伤；外治汤火烫伤。飞龙掌血为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血Toddalia asiatica (L.) Lam.的干燥根，具有散瘀止血，祛风除湿，消肿解毒的功效。根皮：跌打损伤，风湿性关节炎，肋间神经痛，胃痛，月经不调，痛经，闭经；外用治骨折，外伤出血。《广西中药材标准》1996年版第二册收载了飞龙掌血，药用部位为根和茎、云南省中药材标准2005年版第四册收载为飞龙掌血茎。

两面针是我国南方地区常用中药，由于其药理活性强，疗效显著，临床用量日渐增大。据文献报道，由于两面针药材生长周期较长，需求量逐年增加而野生资源不断减少，导致两面针市场混伪现象较严重，同科植物飞龙掌血是最为常见的两面针伪品。两面针标准中含量测定指标为氯化两面针碱，而伪品飞龙掌血中氯化两面针碱含量较高，实际生产中可能存在替代两面针投料生产的情况，造成临床疗效和用药安全隐患。因此，为规范两面针药材市场和保证两面针药材临床疗效和用药安全，需要一种简单可靠，能够准确快速鉴别两面针中伪品飞龙掌血的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物，该鉴别方法简单易行，采用所述方法及鉴别引物能够快速准确的对两面针和其伪品飞龙掌血进行鉴别，从而保证两面针药材的临床疗效和用药安全，有利于两面针药材市场的健康发展。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别引物，该特异性PCR鉴别引物为：上游引物：5´GCTCCCGTCTCTCCGACT 3´ （SEQ ID NO:1）； 下游引物：5´TGACGCTTTTCCAGACTACA3´ （SEQ ID NO:2） 。

一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法，包括以下步骤：

（1）模板DNA提取：取供试品用75%乙醇擦拭表面，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用，称取干燥供试品约20 mg置1.5 mL离心管中；使用新型植物组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA；同时飞龙掌血阳性对照模板DNA溶液，也按照同样方法进行；

（2）PCR反应：

采用所述的特异性PCR鉴别引物：

上游引物：5´GCTCCCGTCTCTCCGACT 3´ （SEQ ID NO:1），

下游引物：5´TGACGCTTTTCCAGACTACA 3´ （SEQ ID NO:2）；

PCR反应体系：反应总体积为20 μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.75μL，模板DNA 1μL，无菌水7.5μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；

反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟；循环反应35次（95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒）；72℃延伸5分钟；

（3）琼脂糖电泳检测：