[发明专利]两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法及鉴别引物

权利要求书

1.一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别引物，其特征在于，该特异性PCR鉴别引物为：上游引物：5´GCTCCCGTCTCTCCGACT 3´，下游引物：5´TGACGCTTTTCCAGACTACA 3´。

2.一种两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）模板DNA提取：取供试品用75%乙醇擦拭表面，晾干；用研磨仪磨成极细粉末备用，称取干燥供试品约20 mg置1.5 mL离心管中；使用新型植物组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA；同时飞龙掌血阳性对照模板DNA溶液，也按照同样方法进行；

（2）PCR反应：

采用权利要求1中所述的特异性PCR鉴别引物：

上游引物：5´GCTCCCGTCTCTCCGACT 3´ ，

下游引物：5´TGACGCTTTTCCAGACTACA 3´；

PCR反应体系：反应总体积为20 μL，反应体系包括2×DNA聚合酶Mix 预混液 10μL，上下游引物10μmol/L 各0.75μL，模板DNA 1μL，无菌水7.5μL补足；另取等体积无菌水代替模板DNA，作为空白对照；

反应条件：将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性5分钟；循环反应35次，95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸5分钟；

（3）琼脂糖电泳检测：

照琼脂糖凝胶电泳法，配置2%琼脂糖电泳，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed,取供试品、飞龙掌血阳性对照产物3～5μl进行上样，DNA分子量标记上样量为2.5μl，电泳结束后在在凝胶成像仪上进行检视；

（4）结果判定：供试品凝胶电泳图中，供试品在200～300bp间不得出现与飞龙掌血对照药材大小一致的条带，空白对照无条带。

3.根据权利要求2所述的两面针中伪品飞龙掌血的特异性PCR鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中使用新型植物组织基因组DNA提取试剂盒提取样品的DNA的具体提取步骤如下：

①采用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒，在装有供试品的离心管中加入400 μL缓冲液LP1，涡旋震荡混匀，室温放置10分钟；加入130 μL缓冲液LP2，充分混匀，涡旋振荡1分钟；12,000rpm离心5分钟，小心将上清转移至新的1.5mL离心管里；

②加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分震荡混匀15秒；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

③重复上一步漂洗过程；将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μL洗脱缓冲液TB，TB已预先在金属浴中加热至65℃；室温放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；

④小心把离心管中所得全部溶液重新悬空滴加至CB3的吸附膜的中间部位，室温放置5分钟，12,000 rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。