[发明专利]一种双模式转录组快速建库的方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种双模式转录组快速建库的方法，步骤包括：富集待测样本中的mRNA；将富集后的mRNA进行片段化处理；以RNA为模板，采用随机引物合成第一链cDNA；同时进行第二链cDNA的合成及末端修复和加A；将步骤(4)获得的末端加A的双链DNA与接头连接；文库扩增。及对应的双模式转录组快速建库试剂盒。本发明的双模式转录组快速建库的方法，将第二链cDNA的合成及2nd cDNA合成后的纯化、末端修复和加A三个过程合并，优化酶成分，建库时间短，操作简便，提高了建库效率，将RNA建库的下线提升到500pg。本发明的试剂盒搭配两种2nd cDNA合成末修及加A试剂组分，既可以完成链特异性也可以选择非链特异性建库，省去了购买两个试剂盒，节省成本。

技术领域

本发明专利涉及一种双模式转录组快速建库的方法及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

近十几年来，二代测序技术发展迅速，在生命科学领域、医学健康领域都得到了广泛的应用。二代测序根据核酸DNA或者RNA类型分为全基因组测序和转录组测序。转录组测序不仅可以检测基因表达谱，还可以检测可变剪接、RNA编辑及，转录组测序还能用于RNA病原的检测，分析RNA病原种类，组装遗传信息及疾病相关抗体转录本表达情况等。因此在生命科学领域、医学领域、疾控检测领域，转录组测序都有广泛的应用。转录组测序首先需要将RNA转换成测序仪能识别文库结构，因此所有的转录测序都需要进行RNA核酸样本的建库过程。传统的RNA建库包含mRNA的富集、RNA的片段化、第一链cDNA的合成、第二链cDNA的合成及2nd cDNA合成后的纯化、末端修复和加A、接头连接及接头连接后纯化、文库扩增及纯化，步骤多，时间长，8hour无法完成转录组的建库，尤其是对多样本建库，操作复杂，用时长。

发明内容

本发明的目的是提供一种双模式转录组快速建库的方法，具有耗时短、节省试剂的优点。

本发明采用的技术方案为：一种双模式转录组快速建库的方法，其步骤包括：

(1)富集待测样本中的mRNA；

(2)将富集后的mRNA进行片段化处理；

(3)以RNA为模板，采用随机引物合成第一链cDNA；

(4)同时进行第二链cDNA的合成及末端修复和加A；

(5)将步骤(4)获得的末端加A的双链DNA与接头连接；

(6)文库扩增；

其中步骤(2)～(4)每个模块都是一个反应组分。

优选的，步骤(1)中mRNA的富集可使用翌圣HieffmRNA Isolation MasterKit mRNA纯化试剂盒(Cat.12603)进行oligo(dT)磁珠进行富集mRNA，或者可以使用翌圣HieffMaxUp rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)MaxUp核糖体RNA去除试剂盒(人/小鼠/大鼠)进行rRNA探针法富集mRNA。

优选的，步骤(2)中RNA的片段化，采取高温下Mg²⁺对RNA进行物理法片段化，将长链RNA随机打断成200～700bp的RNA片段。

优选的，步骤(2)中RNA的片段化，使用的反应程序是94℃～65℃:5～8min，降温到4℃保存。

优选的，步骤(2)的RNA的片段化反应Buffer中含有随机引物N6～N8，在RNA的片段化后降温过程中实现随机引物和片段化后RNA的退火过程。