[发明专利]一种双模式转录组快速建库的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种双模式转录组快速建库的方法，其特征在于其步骤包括：

(1)富集待测样本中的mRNA；

(2)将富集后的mRNA进行片段化处理；

(3)以RNA为模板，采用随机引物合成第一链cDNA；

(4)同时进行第二链cDNA的合成及末端修复和加A；

(5)将步骤(4)获得的末端加A的双链DNA与接头连接；

(6)文库扩增；

其中步骤(2)～(4)每个模块都是一个反应组分。

2.根据权利要求1所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(1)中mRNA的富集使用mRNA纯化试剂盒，采用oligo(dT)磁珠进行富集mRNA；或者使用核糖体RNA去除试剂盒进行rRNA探针法富集mRNA。

3.根据权利要求1所述的一种双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(2)中RNA的片段化，采取高温下Mg²⁺对RNA进行物理法片段化，将长链RNA随机打断成200～700bp的RNA片段。

4.根据权利要求3所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(2)中RNA的片段化，使用的反应程序是94℃～65℃:5～8min，降温到4℃保存。

5.根据权利要求1所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(2)的RNA的片段化反应Buffer中含有随机引物N6～N8，在RNA的片段化后降温过程中实现随机引物和片段化后RNA的退火过程。

6.根据权利要求1所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(3)使用的第一链cDNA合成反应液包含：5～10U/μL SuperScript^TMII反转录酶，1～2U/μL RNase抑制剂，150～250mM pH 8.3的Tris-HCl，200～400mM KCl，10～20mM DTT，5～15mM dNTPs，50～100mg/mL的放线菌素D。

7.根据权利要求6所述的一种双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(3)的第一链cDNA的合成的反应程序是：25℃5～10min，42℃15～30min，70℃10～20min，4℃保存。

8.根据权利要求1所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：所述双模式转录组快速建库包括链特异性建库和非链特异性建库；链特异性建库时步骤(4)使用的的第二链cDNA的合成及末端修复加A的反应液包含：0.2～1U/μl DNA Polymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.2～1U/μl核糖核酸酶H，0.2～1U/μl T4 DNA聚合酶，0.05～0.5U/μlTaq DNA聚合酶，0.2～1U/μl T4多聚核苷酸激酶，50～250mM pH 8.0的Tris-HCl，20～100mM MgCl₂，120～500mM NaCl，10～15mM dNTPs，10～15mM dUTP，60～100mM ATP；非链特异性建库时步骤(4)使用第二链cDNA的合成及末端修复加A的反应液包含：0.2～1U/μl DNAPolymerase I,Large(Klenow)Fragment，0.2～1U/μl核糖核酸酶H，0.2～1U/μl T4 DNA聚合酶，0.05～0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.2～1U/μl T4多聚核苷酸激酶，50～250mM pH 8.0的Tris-HCl，20～100mM MgCl₂，120～500mM NaCl，10～15mM dNTPs，60～100mM ATP。

9.根据权利要求8所述的双模式转录组快速建库的方法，其特征在于：步骤(4)的第二链cDNA的合成及末端修复加A的反应程序为16℃10～45min，72℃10～20min，4℃保存。