[发明专利]一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，包括以下步骤：S1、组织样品处理：称取约1g的各组织样品，加图1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；S2、病毒基因组DNA提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒基因组；本发明针对马立克氏病Meq基因的保守序列，设计了专门的引物和探针，并且使用多酶恒温快速扩增技术(MIRA)对马立克氏病，建立一种在常温下能快速扩增核酸的技术，提高了分子生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测时间。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法。

背景技术

鸡马立克氏病(MD)的致病原是B群疱疹病毒,该病毒具有导致家禽多器官组织产生肿瘤性病变及外周神经发生淋巴细胞浸润的病理作用。患本病后，除少数病鸡能痊愈康复外，一般都死亡。其病死率与发病率几乎相等，对养禽业危害较为严重。因此，对马立克氏病的诊断对养禽业具有十分重要的意义。目前，检测MDV的方法有病原分离与鉴定，ELISA，琼脂扩散实验及PCR等。传统的检测方法费时费力，PCR检测方法虽然灵敏度高，但极易污染。MIRA反应迅速，灵敏度高，且不需要复杂的仪器，是检测的首选。

为了建立快速检测马立克氏病的MIRA方法，本研究针对马立克氏病Meq基因的保守序列，使用多酶恒温快速扩增技术(MIRA)对马立克氏病，建立一种在常温下能快速扩增核酸的技术。本研究成功建立了一种快速、简便、特异性高、灵敏度好的分子生物学检测诊断方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，解决了传统的检测方法费时费力，PCR检测方法虽然灵敏度高，但极易污染的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于MIRA荧光法快速检测马立克氏病病毒的检测方法，包括以下步骤：

S1、组织样品处理：称取约1g的各组织样品，加图1mL PBS后放入研磨钵中研磨成匀浆，转移至无菌离心管中，在离心机中以8500rpm/min离心3min；

S2、病毒基因组DNA提取：使用某生化科技有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取病毒基因组；

S3、引物与探针设计：在GenBank中检索马立克氏病病毒的Meq基因，通过Meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在Primer Premier 5的辅助下，设计Meq基因特异性MIRA引物和探针；根据马立克氏病病毒的Meq基因片段大小为1020bp，在Primer Premier 5的辅助下设计全长引物，进行PCR扩增；

S4、PCR产物回收及纯化：根据SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；

S5、标准质粒的构建：根据pMD^TM19-T Vector Cloning Kit使用说明书，构建pMD-19T-MDV-Meq重组质粒；

S6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在NCBI网站的BLAST功能和Meglign软件与基因全长进行比对分析；

S7、质粒DNA小量抽提：根据SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒使用说明书，提取构建的pMD-19T-MDV-Meq重组质粒备用；

S8、马立克氏病病毒荧光检测体系建立

S81、体系建立：根据DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书，进行荧光结果检测体系建立；